Test biosensoryczny konduktometryczny na bazie β-laktamazy do interakcji białko-białko

Streszczenie

Źródło: Vandevenne, M., et al. Użycie konduktometrycznego testu biosensorycznego opartego na β-laktamazie do wykrywania oddziaływań biomolekularnych. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje test biosensoryczny konduktometryczny do badania interakcji przeciwciała z docelowym antygenem unieruchomionym na chipie przetwornika. Bioczujnik został zaprojektowany tak, aby zawierał dwufunkcyjne białko chimeryczne – enzym β-laktamazy z funkcjonalnym miejscem katalitycznym połączonym z nanolitem w celu związania się z unieruchomionym antygenem docelowym. Po związaniu katalityczna hydroliza substratu antybiotykowego przez enzym β-laktamazę generuje sygnał elektryczny – potwierdzający interakcję antygen-przeciwciało.

Protokół

1. Przygotowanie próbki białka

1. Wyprodukuj i oczyść białko hybrydowe BlaP-cAb-Lys3, jak opisano w naszym poprzednim badaniu. Przechowywać białko w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7,4 o następującym składzie: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ i 0,24 g KH₂PO₄ rozpuszczone w 800 ml wody destylowanej Ustalić pH roztworu na 7,4 przed dostosowaniem końcowej objętości roztworu do 1 l. Przefiltrować wysterylizować roztwór białka.
2. Przygotować roztwór podstawowy lizozymu białka jaja kurzego (HEWL). Rozpuścić 100 mg (40 000 jednostek/mg) zakupionego w handlu HEWL w 10 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS, patrz krok 2.1.1). Wysterylizuj roztwór białkowy przez filtrację za pomocą filtrów z odcięciem 0,22 μm.

2. Testy biosensorów

1. Przygotowanie roztworu i buforu
   1. Przygotować 50 mM PBS, rozpuszczając 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ i 0,24 g KH₂PO₄ w 800 ml wody destylowanej. Doprowadzić do pH 7,4 za pomocą 1 N HCl lub 1 N NaOH przed dostosowaniem objętości roztworu do 1 l. Przefiltrować-wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotować roztwór nasycający/blokujący, rozpuszczając 3 g hydrolizatu kazeiny w 100 ml PBS przygotowanego w sposób opisany powyżej (patrz krok 2.1.1). Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   3. Przygotować roztwór wiążący, rozpuszczając 1 g hydrolizatu kazeiny w 100 ml PBS przygotowanego w sposób opisany powyżej (patrz krok 2.1.1). Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   4. Przygotować roztwór do przemywania (0,1% Tween - PBS), dodając 100 μL Tween 20 (100%) do 100 ml PBS przygotowanego w sposób opisany powyżej (patrz krok 2.1.1). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   5. Przygotować roztwór do przygotowania elektrody (1% Triton X-100 - PBS), dodając 1 ml Triton X-100 (100%) do 100 ml PBS przygotowanego w sposób opisany powyżej (patrz krok 2.1.1). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   6. Przygotować roztwór do regeneracji elektrod (3,5 M KCl), rozpuszczając 26 g KCl w wodzie destylowanej do końcowej objętości 100 ml. Filtr wysterylizowany i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   7. Przygotować 5 mM roztwór NaCl, rozpuszczając 0,29 g NaCl w wodzie destylowanej do końcowej objętości 1 l. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C. Następnie należy przygotować roztwór detekcyjny (4 mM penicyliny benzylowej), rozpuszczając 26,7 mg penicyliny benzylowej w 20 ml 5 mM roztworu NaCl. Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Przygotowanie i regeneracja czujnika
   nuta: Chipy czujników pokryte polianiliną zostały opracowane i udostępnione dzięki uprzejmości dr P. Bogaertsa, dr S. Yunusa i prof. Y. Glupczynskiego (Katolicki Uniwersytet w Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Opis czujnika, jak również protokoły elektropolimeryzacji polianiliny stosowane do syntezy tych czujników są szczegółowo opisane w ich poprzednich pracach. Krótko mówiąc, system ten wykorzystuje czujniki wielokrotnego użytku składające się z ośmiu pojedynczych chipów, które zostały wyprodukowane przy użyciu klasycznych technik obwodów drukowanych (PCB). Poszczególne wióry składają się z trzech okrągłych punktów elektrody. Górna z nich to elektroda robocza, na której elektrosyntezowano polianilinę. Środkowa z nich to elektroda odniesienia, a dolna elektroda stanowi przeciwelektrodę. Zarówno elektroda referencyjna, jak i przeciwelektroda są funkcjonalizowane za pomocą stałego amalgamatu Ag/AgCl na wierzchu warstwy węglowej.
   1. Wykonać 3 płukania elektrod, zanurzając końcówki w dołkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 μl/studzienkę roztworu do przygotowania elektrod (1% Triton X-100 - PBS, patrz krok 2.1.5.). Wykonuj każde pranie przez 2 minuty z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
   2. Przepłukać elektrody, zanurzając końcówki w studzienkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 μl/studzienkę wody destylowanej na 2 minuty z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
   3. Zregenerować elektrody, zanurzając końcówki w studzienkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 μl/studzienkę roztworu regeneracyjnego (3,5 M KCl, patrz krok 2.1.6) przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   4. Wykonać 3 płukania elektrod, zanurzając końcówki w studzienkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 μl/studzienkę soli fizjologicznej buforu fosforanowego (patrz krok 2.1.1.). Wykonuj każde pranie przez 2 minuty z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
3. Test wiązania przeprowadzony na czujniku
   1. Pokryj HEWL na powierzchni PANI (polianiliny) elektrody, nanosząc na powierzchnię elektrody kroplę 15 μl 40 μg/ml HEWL przygotowanej w PBS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. Wykonać trzy płukanie elektrod solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (patrz krok 2.1.1), zanurzając części elektrod chipów czujnika w studzienkach 96-dołkowej płytki zawierającej 300 μl/studzienkę soli fizjologicznej buforu fosforanowego. Wykonuj każde pranie przez 2 minuty z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
   3. Nasycić elektrody, dodając 50 μl kropli roztworu blokującego (patrz krok 2.1.2) na powierzchnię elektrody. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj trzy razy, jak opisano w poprzednim kroku (patrz krok 2.3.2).
   4. Rozcieńczyć roztwór BlaP-cAb-Lys3 do 20 μg/ml w roztworze wiążącym (patrz krok 2.1.3) i nanieść 15 μl kropli tego rozcieńczonego roztworu na elektrody. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po reakcji antygen-nanonik przemyć trzykrotnie, jak opisano w poprzednim kroku, roztworem do przemywania (patrz krok 2.1.4). Następnie przepłukać elektrodę raz PBS (patrz krok 2.1.1).
   5. W celu wykrycia podłącz chip czujnika za pomocą części miedzianej do multimetru cyfrowego. Następnie zainicjuj reakcję czujnika, nakładając kroplę roztworu detekcyjnego o wielkości 50 μl (patrz krok 2.1.7) na elektrody dodatnie i nanosząc kroplę 50 μl roztworu NaCl 5 mM na elektrody ujemne (patrz krok 2.1.7). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Monitoruj przewodność za pomocą multimetru cyfrowego.
      nuta: Multimetr został dostarczony przez dr. P. Bogaertsa, dr. S. Yunusa i prof. Y. Glupczynskiego (Katolicki Uniwersytet w Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Ten potencjostat jest sterowany komputerowo przez port USB i jednocześnie analizuje osiem różnych chipów czujnika. Oprogramowanie stworzone przez Yunusa i jego współpracowników tworzy wykres w czasie rzeczywistym, który przedstawia pomiary różnicy przewodności między elektrodami referencyjnymi i próbkowymi w funkcji czasu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7653
Tris-HCl	Roche	10812846001
Edta	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy E9884
Kcl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M6250
alanina	Sigma-Aldrich	A7627
HClO4	Przywra	Numer katalogowy: 34288	1M roztwór HClO4, dystrybutor : Sigma-Aldrich
Hydrolizat kazeiny	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy 22090
Penicylina benzylowa sodowa	Sigma-Aldrich	B0900000
Lizozym białka jaja kurzego	Roche	10837059001
heptan	Sigma-Aldrich	246654
metanol	Sigma-Aldrich	322415
Roztwór wodorotlenku amonu	Sigma-Aldrich	380539	28% NH3 w H2O, oczyszczone przez podwójną destylację (zagęszczone?)
Materiały eksploatacyjne do laboratoriów
Płytka 6-dołkowa	Greiner Bio-One	657165	Płytka 6-dołkowa CELLSTAR
sprzęt
pH-metr	WTW	Zobacz materiał 1AA110	Laboratoryjny pH-metr inoLab pH 7110
System próżniowy i filtracyjny	Nalgene powiedział:	NALG300-4100	Uchwyty filtrów z odbiornikiem, rozdzielaczem : VWR
Układy czujników potencjometrycznych			wyprodukowany przez Yunusa i współpracowników (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		wycofany, następca Autolab PGSTAT302N
Multimetr cyfrowy, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		wycofany, następca Metrahit Base

powiedział: powiedział: TGL TGL