1. Komórki
- Dwa dni przed rozpoczęciem procedury należy poszczepić komórki pod wymaganą gęstością, aby zlewały się w dniu eksperymentu. Umieść komórki w kolbach lub płytkach. Jednak ekstrakcja białka będzie łatwiejsza z płytek. Wygodnie jest przygotować co najmniej 4 płytki po 78 cm2 lub 2 kolby po 150 cm2 na warunek na eksperyment, aby mieć pewność, że wyniki są spójne.
- W tym badaniu płytki ludzkie G166 GSC w 4 kolbach o długości 150 cm2, hodowane w pożywce z komórek macierzystych RHB-A uzupełnionej 2% B27, 1% N2, 20 ng / ml EGF i b-FGF, jak opisano przez Pollarda i wsp. Proces, gdy osiągnięto zbieg. Na przykład, gdy 5 x 106 komórek G166 zostało posianych w kolbie o średnicy 150cm2, zostały one przetworzone 2 dni po posiewaniu.
2. Biotynylowane CPP
- Obracać fiolki zawierające liofilizowane biotynylowane CPP (BCPPs) w temperaturze 8200 x g przez 30 s, aby uniknąć pozostawienia części proszku na pokrywce. Dołącz kontrolny BCPP, aby upewnić się, że znalezione interakcje są specyficzne dla sekwencji docelowej. W tym badaniu kontrolnym BCPP była TATbiotyna (TAT-B), a leczonym BCPP był TAT-Cx43266-283-B. Można zastosować inne kontrole, takie jak TAT połączony z zaszyfrowanymi lub zmutowanymi fragmentami związanymi z biotyną.
- Rozpuścić BCPP w odpowiednim roztworze podstawowym do roztworu podstawowego wskazanego przez producenta; na przykład, aby otrzymać roztwór podstawowy 2 mg/ml BCPP do traktowania GSC, dodać 0,5 ml pożywki hodowlanej GSC do jednej fiolki zawierającej 1 mg BCPP. Odwiruj i upewnij się, że peptyd jest dobrze rozpuszczony.
3. Rury
UWAGA: Przygotuj co najmniej dwanaście probówek 1,5 ml na każdy warunek wymagany w Sekcji
- Zaznacz pierwsze 3 probówki na warunek. Będą one miały całkowitą objętość lizatów komórkowych uzyskaną w kroku 6.4.
- Zaznacz A w 3 probówkach na warunek. Probówki te będą zawierały pierwsze supernatanty uzyskane po lizie i przędzeniu lizatów komórkowych, krok 7.2.
- Zaznacz B w 3 probówkach na warunek. Probówki te będą miały małą porcję pierwszych supernatantów. Lizaty te posłużą jako próbki Western blot w kroku 7.3.
- Zaznacz C w 3 probówkach na warunek. Probówki te będą zawierały supernatanty otrzymane po ściągnięciu za pomocą NeutrAvidin, krok 7.7.
nuta: Jest to ważne w przypadku, gdy Western blot nie wykazywał sygnału dla białek, co oznacza, że białka nie zostały ściągnięte w dół lub zostały utracone na pewnym etapie procedury. W takiej sytuacji powtórz proces, aby ściągnąć białka w dół.
4. Leczenie komórkowe za pomocą BCPPs
- Odessać pożywkę hodowlaną.
- Odpowiednią objętość świeżej pożywki wymaganą do inkubacji BCPP należy zastąpić w najmniejszej możliwej objętości pożywki, zgodnie z czasem inkubacji. Bardzo ważne jest, aby w każdym przypadku pożywka pokrywała całkowicie całą powierzchnię płytki/kolby, tak aby komórki nie wysychały, na przykład 6 ml na 150cm2 przez 30 minut inkubacji.
- Dodać objętość roztworu podstawowego BCPP do kultur komórkowych, aby osiągnąć stężenie, które okazało się skuteczne. W tym badaniu udowodniono, że 50 μM TAT-Cx43266-283-B zmniejsza proliferację GSC.
- Dlatego dodać 92,8 μl 2 mg/ml TAT-Cx43266-283-B (MW = 3723,34 g/mol) na ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μM TAT-Cx43266-283-B. Jeżeli objętość, która ma być dodana, jest inna dla peptydów kontrolnych, należy uzupełnić pożywką hodowlaną do tej samej objętości końcowej. Na przykład 49,1 μL TAT-B (MW = 1914,31 g/mol) plus 43,7 μL pożywki GSC dodano na ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μM TAT-B.
- Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut, aby upewnić się, że zachodzą interakcje między BCPP a jego wewnątrzkomórkowymi partnerami. Jeśli interakcja trwa dłużej, inkubuj przez dłuższy czas lub dostosuj czasy, jeśli eksperyment składał się z przebiegu czasowego. Ponadto interesująca interakcja może być promowana lub zapobiegana poprzez stymulację różnych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych.
5. i roztwory
- Przygotować PBS pH 7,4: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4.
- Przygotuj bufor do lizy białek: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, Przed użyciem dodaj: 1/100 (v/v) koktajl inhibitorów proteazy, 1 mM fluorek sodu, 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF) i 0,1 mM ortowanadan sodu.
- Przygotować bufor Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glicerol; 3,7 % SDS (p/v); 0,6 M β-merkaptoetanol lub 9 mM DTT; 0,04 % (v/v) błękit bromofenolowy (BB)).
6. Ekstrakcja białka
UWAGA: Ekstrakcja białka została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem. Przeprowadzić całą tę sekcję procedury w temperaturze 4 °C.
- Całkowicie odessać pożywkę hodowlaną.
- Przemyj 3 x 10 ml lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 150 cm2 bardzo ostrożnie, aby uniknąć oderwania komórek.
- Aby uzyskać lizat komórkowy, dodaj 3 ml buforu do lizy na 150cm2 i dokładnie zeskrob powierzchnię za pomocą skrobaka do komórek. Przechylenie płytki/kolby o około 45 stopni ułatwi zebranie lizatów komórkowych do odpowiednich probówek.
- Wlej 1 ml lizatu komórkowego na probówkę do trzech probówek o pojemności 1,5 ml. Probówki te zostaną oznaczone warunkiem i powtórzeniem, jak wskazano w kroku 3.1.
7. Ściąganie
- Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml o stężeniu 11 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Przenieść supernatanty do nowych probówek (A).
- Pobrać podwielokrotność tego supernatantu na każdy warunek do różnych probówek (B), tj. 50 μl na probówkę. Dodać 4x bufor Laemmli (16,6 μl na 50 μl lizatu) i zamrozić w temperaturze -20 °C. Lizaty te będą służyć jak zwykłe próbki Western blot.
- Bardzo dobrze homogenizować agarozę NeutrAwidyny przez delikatne potrząsanie. Odetnij końcówki końcówek pipet, aby zwiększyć ich średnicę i poprawić pipetowanie kulek. Dodać 50 μl agarozy neutrowidyny na ml lizatu komórkowego w probówkach (A).
- Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, bardzo delikatnie wstrząsając, aby umożliwić NeutrAvidin interakcję z BCPP związanymi ze swoimi partnerami wewnątrzkomórkowymi.
- Wirować przy 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C w celu zebrania kompleksu NeutrAwidyny z białkami.
- Ostrożnie usunąć supernatanty i przenieść je do czystych probówek (C). Zachowaj je, aby z nich skorzystać na wypadek, gdyby ściąganie się nie powiodło.
- Etapy mycia: dodać świeży bufor do lizy do granulek (probówek A), ponownie zawiesić przez odwrócenie i powtórzyć kroki 7.6 i 7.7 jeszcze pięć razy. Wszystkie te supernatanty można odrzucić.
- Usunąć supernatanty i dodać 2x bufor Laemmli do żądanej objętości końcowej (40 μl na 1,5 ml probówki dla granulek otrzymanych z cm2 kolb zlewających się komórek).
- Eluować w temperaturze 100 °C przez 5 minut w celu dysocjacji oddziaływań między białkami i wirować przez 30 s przy 8 200 x g w celu osadzania kulek NeutrAwidyny.
- Pobrać supernatanty, zawierające zdysocjowane białka, z końcówkami kapilarnymi do nowych probówek (D). Koraliki można przechowywać na wypadek, gdyby wymagane było powtarzanie etapów elucji.
nuta: Supernatanty (probówki D) są teraz gotowe do załadowania w Western blot lub do zamrożenia w temperaturze -20 °C.
