Biotynylowana sonda peptydowa penetrująca komórki do wykrywania interakcji białko-białko

Streszczenie

Źródło: Jaraíz-Rodríguez, M. et al., Biotynylowane peptydy penetrujące komórki do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje biotynylowane peptydy penetrujące komórki do wykrywania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko. Peptydy penetrujące komórki ułatwiają sprzężonemu peptydowi wnikanie do komórki i specyficzne wiązanie się z oddziałującymi z nią białkami. Biotyna, po związaniu się z awidyną, umożliwia oczyszczenie kompleksu białek oddziałujących z lizatu komórkowego.

Protokół

1. Komórki

1. Dwa dni przed rozpoczęciem procedury należy poszczepić komórki pod wymaganą gęstością, aby zlewały się w dniu eksperymentu. Umieść komórki w kolbach lub płytkach. Jednak ekstrakcja białka będzie łatwiejsza z płytek. Wygodnie jest przygotować co najmniej 4 płytki po 78 cm² lub 2 kolby po 150 cm² na warunek na eksperyment, aby mieć pewność, że wyniki są spójne.
2. W tym badaniu płytki ludzkie G166 GSC w 4 kolbach o długości 150 cm², hodowane w pożywce z komórek macierzystych RHB-A uzupełnionej 2% B27, 1% N2, 20 ng / ml EGF i b-FGF, jak opisano przez Pollarda i wsp. Proces, gdy osiągnięto zbieg. Na p....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia G166 GSC	Przedstawiciel firmy BioRep
Pożywka z komórek macierzystych RHB-A	Takara	Y40001
Białko myszy lamininy	Invitrogen, Technologie Życia, ThermoFisher Scientific	23017-015	10 μg/ml
B-27 Suplement bez serum (50X)	Invitrogen, Technologie Życia, ThermoFisher Scientific	Numer katalogowy: 17504-044	2 proc
Suplement N-2 (100x)	Invitrogen, Technologie Życia, ThermoFisher Scientific	Numer katalogowy: 17502-048	1 proc
Rekombinowany ludzki EGF	Peprotech	AF-100-15	20 ng/ml
Rekombinowany ludzki b-FGF	Peprotech	AF-100-18B	20 ng/ml
PBS pH 7,4: W wodzie dejonizowanej, 136 mM NaCl ; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4
Tat	Język GenScript		Zamówienie
TAT-B	Język GenScript		Zamówienie
TAT-CX43266-283	Język GenScript		Zamówienie
TAT-Cx43266-283-B	Język GenScript		Zamówienie
Pierce™ NeutrAwidin™ Agaroza	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 29200
Bufor do lizy białek: 5 mM Tris HCl (pH 6,8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA
Fluorek sodu	PanReac AppliChem	141675	1 mM
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7626	1 mM
Ortowanadan sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S6508	0,1 mM
Bufor Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glicerol; 3,7 % (w/v) SDS; 0,6 M β-merkaptoetanol lub 9 mM DTT; 0,04% (v/v) błękit bromofenolowy (BB) .

powiedział: . . powiedział: