1. Komórki poszycia
- Na dzień przed transfekcją należy posączyć 3,5 x 106 HEK293T komórek w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny (10 000 U/ml zapasu) na 100 mm szalki. Talerz 3 - 5 100 mm2 szalki na eksperyment/warunek, aby zapewnić wystarczający odzysk białka.
nuta: Liczba płytek musi być określona dla każdego eksperymentu/warunku, który będzie zależał od poziomów ekspresji i rozpuszczalności kompleksu białkowego będącego przedmiotem zainteresowania. Alternatywnie, jeśli potrzebne jest oczyszczanie na większą skalę, linie komórkowe można przystosować do wzrostu w zawiesinach w kolbach przędzalniczych, ale ta metoda nie będzie działać w przypadku transfekcji przejściowych.
2. Transfekcja komórek lub indukowanie stabilnych linii komórkowych
- Następnego dnia sprawdź komórki pod mikroskopem. Komórki muszą być zlewane w 70 - 80% przed kontynuowaniem.
- Transfekować komórki całkowitą mieszaniną 7 μg plazmidowego DNA i 21 μl odczynnika do transfekcji na 100 mm szalkę. Komórki transfekcyjne z wektorem wyrażającym GFP (Tabela 1) jako kontrola skuteczności transfekcji.
nuta: W przypadku stosowania HEK293-T-REx lub podobnej stabilnej linii komórkowej, która indukuje ekspresję dwóch lub więcej złożonych podjednostek w odpowiedzi na doksycyklinę, induktor będzie musiał zostać dodany do komórek i inkubowany przez 48 godzin. Podobnie, stabilna linia komórkowa, która indukuje ekspresję GFP po dodaniu induktora, byłaby również wymagana do celów walidacji. Przejdź do kroku 2.7.
- Przygotuj mieszaninę transfekcji na 100 mm szalka. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszać 500 μl nieuzupełnionego DMEM z 7 μg całkowitego plazmidowego DNA (co odpowiada dwóm lub więcej plazmidom). W oddzielnej probówce do mikrowirówki zmieszać 500 μl nieuzupełnionego DMEM z 21 μl odczynnika do transfekcji. Powtórz tę czynność dla każdej reakcji transfekcji.
- Odpipetować roztwór odczynnika do transfekcji do roztworu plazmidowego DNA (nie mieszać roztworów w odwrotnej kolejności). Wymieszać pipetując co najmniej 4 razy.
- Inkubować tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 - 15 minut, ale nie dłużej niż 15 minut.
- Przechylić płytkę, aby utworzyć zbiornik na pożywkę i ostrożnie pipetować mieszaninę transfekcji kroplami na wewnętrzną stronę płytki, nie naruszając komórek. Przywróć naczynie do pierwotnej płaskiej pozycji i delikatnie obracaj, aby rozprowadzić mieszankę.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% stężeniem CO2 (stan ten jest dalej określany jako "inkubator do hodowli tkankowych"). Wymień nośnik 5 godzin po transfekcji (opcjonalnie).
3. Sprawdzanie wydajności transfekcji lub indukcji
- Po 24 godzinach od transfekcji zwizualizuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby sprawdzić skuteczność transfekcji (lub indukcji kontrolnej HEK293T-REx stabilnej linii komórkowej eksprymującej GFP). Inkubować przez kolejne 24 godziny.
4. Oczyszczanie powinowactwa STREP (STREP AP)
- Zbieranie komórek
- Po 48 godzinach od transfekcji usuń pożywkę i dodaj 8 ml zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Pipetować w górę i w dół, aby odłączyć komórki od płytki.
- Zebrać i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
- Usunąć supernatant PBS. Powtórzyć odwirowywanie w dół (800 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C), aby usunąć wszelkie pozostałości PBS. Przechowuj osad komórkowy w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości lub postępuj zgodnie z poniższą procedurą, aby kontynuować oczyszczanie białka.
- Liza komórek
- Ponownie zawiesić granulki komórkowe za pomocą 5× objętości osadu komórkowego (~ 250 μl na płytkę) pasywnego buforu do lizy (PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, tabletka koktajlowa inhibitora proteazy, 5% v/v glicerolu i 1,0% NP-40) i przenieść zawiesinę komórkową do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Krótko wirować zawiesinę i nutować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
- Wirować zawiesinę komórek w temperaturze 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Przenieś rozpuszczalne lizaty do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wyrzuć granulki komórek. Zaoszczędź 10% końcowej objętości rozpuszczalnego lizatu jako "STREP AP Input." Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Równoważenie koralików STREP
nuta: Użyj koralików STREP w pierwszym kroku AP! Kompleksy ściągnięte za pomocą kulek STREP odzyskują znacznie więcej białka niż te ściągnięte za pomocą kulek FLAG.
- Wyjąć (n × 40 μl) + n μl 50% zawiesiny z kulek STREP (n = liczba próbek) i odwirowywać przy 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Do pipetowania koralików używaj końcówek z szerokimi otworami.
- Usunąć supernatant i dodać 500 μl PLB do kulek. Nutować mieszaninę kulek przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wirować w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
- Powtórz w sumie 3 prania. Zawiesić kulki w PLB do końcowej objętości n × 40 μl.
- Dodać 40 μl 50% zawiesiny kulki STREP do każdej próbki lizatu komórkowego i nutować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
- PAK PA (ang.)
- Odwirowywać roztwór o sile 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
- Usunąć supernatant i przechowywać go w temperaturze 4 °C jako "STREP AP Flow-through (FT)".
- Dodać 500 μl STREP AP Wash Buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glicerolu i 0,2% NP-40) do kulek. Mieszaninę kulek należy nutować przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odwirowywać w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
- Powtórz w sumie 4 prania.
nuta: Przed czwartym płukaniem przenieś roztwór kulek do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby zredukować tło białkowe. Ten krok jest niezbędny.
- Dodaj 500 μl buforu do przemywania II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl i 1 mM EDTA) i zrównoważyć kulki, odwracając probówki. Wirować w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant.
- Eluować interesujące białko za pomocą 50 μl buforu elucyjnego STREP (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA i 2,5 mM Destiobiotyny). Wirować przy 800 obr./min przez 15 min w temperaturze 4 °C.
- Wirować kulki w temperaturze 1 500 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant. Frakcja ta odpowiada próbce "STREP AP Elution".
- Zachowaj frakcję kulek w temperaturze 4 °C do drugiej elucji, która może dać do połowy ilości białka uzyskanej przy pierwszej elucji. Porcja 10% wylucju STREP AP do barwienia srebrem i/lub western blot.
- Równoważenie koralików FLAG
- Wyjąć (n x 16 μl) + n μl roztworu kulek FLAG (n = liczba próbek) i wirować w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
nuta: Użyj końcówek z szerokimi otworami do pipetowania koralików.
- Usunąć supernatant i dodać 500 μl buforu płuczącego FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA i 0,1% NP-40) do kulek. Wirować w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Powtórz tę czynność, w sumie 3 prania.
- Zawiesić kulki w buforze do płukania FLAG do końcowej objętości n x 16 μl.
- Dodać 16 μl zawiesiny perełkowej FLAG do pozostałej elucji STREP AP i nutować przez noc w temperaturze 4 °C.
5. FLAGA IP
- Zawiesinę kulek FLAG należy obracać w temperaturze 1.500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Zachowaj supernatant i przechowuj go jako "FLAG IP Flow-through" (FT) w temperaturze 4 °C.
- Do roztworu dodać 500 μl buforu do płukania FLAG. Nutować przez 5 minut w temperaturze 4 °C i wirować w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Powtarzać w sumie przez 4 płukania i usuwać supernatant po każdym przemyciu.
nuta: Przed czwartym płukaniem przenieś roztwór kulek białkowych do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby zredukować tło. Ten krok jest niezbędny.
- Usunąć supernatant z ostatniego wirowania i dodać 30 μl buforu płuczącego FLAG zawierającego 200 ng/μl peptydu FLAG do kulek. Wirować przy 800 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
- Odwirowywać zawiesinę w temperaturze 1 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C jako "FLAG IP Elution"
nuta: Próbki elucji mogą być potwierdzone za pomocą barwienia srebrem i/lub western blot przy użyciu standardowych protokołów i są gotowe do dalszych testów białka. Podczas ustawiania western blot uruchom wszystkie następujące próbki: (1) wejście STREP AP, (2) STREP AP FT, (3) ELUCJA STREP AP, (4) FLAG IP FT i (5) ELUCJA FLAG IP. Załadowane woluminy będą musiały zostać określone dla każdego eksperymentu. Wszystkie pobrane próbki i kulki można przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania i w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania. Próbki TAP mogą być analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu zweryfikowania tożsamości ich składników, identyfikacji nowych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) i/lub odkrycia wszelkich nowych interakcji białkowych z oczyszczonym kompleksem. W tym celu, po nałożeniu żelu coomassie lub srebrnej plamy, opaski można wyciąć z żelu za pomocą czystego skalpela. Wcześniej opublikowano kilka doskonałych recenzji, które omawiają metody spektrometrii mas.