$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Na potrzeby niniejszego badania, w testach immunoenzymatycznych zamiast CV-N zastosowano białko fuzyjne CVN-małego modyfikatora ubikwityny (SUMO) i jest ono odpowiednie do testów komórkowych. Rekombinowane białko HA H3 wirusa grypy A o pełnej długości jest otrzymywane w handlu (patrz tabela materiałów) lub ulega ekspresji w liniach komórkowych HEK293 ssaków i komórkach owadów zakażonych bakulowirusem zgodnie ze standardowymi protokołami. Białko kolca Wuhan-1 ulega ekspresji w komórkach HEK293 ssaków. Synteza peptydu mon-mannozylowanego (MM) i peptydu di-mannozylowanego (DM) pozwala na wykrycie jednorodnych ligandów do CVN2 i monomannozylowanych małych cząsteczek.
1. Tworzenie konstrukcji CV-N
- Dla każdego z wariantów CVN2 i białka CVN2L0 (PDB ID 3S3Y) należy uzyskać konstrukt genu z N-końcową sekwencją lidera pelB i znacznikiem Hisa w wektorze pET27b(+) ze źródeł komercyjnych (patrz tabela 1).
- Uzyskaj CVN2L0 i jego warianty (V2, V3, V4 i V5; Rysunek 1A,C) w tle genu matrycowego CVN2L0 składającego się z dwóch odrębnych sekwencji DNA dla każdego powtórzenia CV-N.
- Rozpuścić liofilizowane plazmidowe DNA w sterylnej dejonizowanej wodzie destylowanej (ddH2O) do końcowego stężenia 100 ng/μL.
2. Przygotowanie płytek LB-agar z komórkami przekształconymi w plazmidowe DNA
- Przygotować pożywkę hodowlaną LB-Lennox, rozpuszczając 10 g/l peptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 5 g/l NaCl w ddH2O (patrz tabela materiałów) i dostosować pH do 7,4. Przeprowadzić transformację w kompetentną E. coli BL21 (DE3) dla każdego wariantu (V2-V5) metodą chemiczną zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem.
- Podzielić roztwór (900 μl i 100 μl), przenieść 100 μl na płytki LB-agar (50 μg/ml kanamycyny) i delikatnie użyć sterylnego rozsiewacza komórek. Inkubować płytki agarowe przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Klonowanie
- Subklonować gen CV-N do miejsc NdeI i BamHI pET11a (patrz tabela materiałów) w celu przekształcenia (elektroporacji) w komórki elektrokompetentne po odwołaniu.
4. Mutageneza kierowana na stronę
- Generowanie CVN2L0 i zmutowanego CVN-E41A w tle genu matrycowego CVN2L0 zawierającego dwie odrębne sekwencje DNA dla każdego powtórzenia CV-N.
- Dokonać mutacji za pomocą zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce (patrz tabela materiałów) i specyficznych starterów mutagennych 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' i 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' do przeprowadzenia PCR.
- Rozpocznij serię reakcji próbek przy użyciu wielu stężeń matrycy dwuniciowego DNA (dsDNA) w zakresie od 5 do 50 ng (np. 5, 10, 20 i 50 ng matrycy dsDNA). Utrzymuj stałe stężenie podkładu.
nuta: Mieszanina PCR i protokół cykli termicznych są zwykle stosowane zgodnie z opisem w instrukcji obsługi zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.
- Dodać enzym restrykcyjny DpnI (1 μl, 10 U/μl, patrz tabela materiałów) poniżej nakładki oleju mineralnego. Dokładnie i delikatnie wymieszać reakcje, odwirować w mikrowirówce stołowej przez 1 minutę i natychmiast inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu wytrawienia rodzicielskiego superskręconego dsDNA.
5. Transformacja komórek bakteryjnych
- Delikatnie rozmrozić superkompetentne ogniwa XL1-Blue (patrz tabela materiałów) na lodzie. Aby przekształcić każdą reakcję kontrolną i próbkę, należy podwielokrotnić nadkompetentne komórki (50 μl) do wstępnie schłodzonej okrągłej probówki z polipropylenu (14 ml).
- Przenieść 1 μl jednoniciowego DNA (ssDNA) poddanego działaniu Dpn I z każdej reakcji kontrolnej i próbki (zmutowany ssDNA) do oddzielnych podwielokrotności komórek superkompetentnych, które syntetyzują nić komplementarną. Ostrożnie zamieszać reakcje przemiany, aby wymieszać i inkubować reakcje na lodzie przez 30 min.
nuta: Przed przeniesieniem DNA poddanego działaniu Dpn I do reakcji przemiany zaleca się ostrożne usunięcie pozostałego oleju mineralnego z końcówki pipety. Jako opcjonalną kontrolę, wydajność transformacji superkompetentnych komórek XL1-Blue musi być sprawdzana przez zmieszanie 0,1 ng/μL plazmidu kontrolnego pUC18 (1 μL) z 50 μl podwielokrotnością superkompetentnych komórek.
- Zastosować impuls cieplny do reakcji przemiany w temperaturze 42 °C przez 45 s, a następnie umieścić reakcje na lodzie na 2 min.
nuta: Zastosowany impuls cieplny został już zoptymalizowany pod kątem wymienionych warunków w okrągłodennych probówkach z polipropylenu (14 ml).
- Dodać 0,5 ml bulionu NZY+ (zawierającego na litr: 10 g aminy NZ (hydrolizatu kazeiny), 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 12,5 ml 1 M MgCl2, 12,5 ml 1 MMgSO4, 10 ml 2 M glukozy, pH 7,5 i podgrzanego do 42 °C) i inkubować reakcje przemiany w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225-250 obr./min przez 1 godzinę. Pokryć odpowiednią objętość każda reakcja przemiany (5 μL z kontrolnej przemiany plazmidowej; 250 μL z przemiany próbki) na płytkach agarowych LB-ampicyliny.
nuta: W celu kontroli przemiany i mutagenezy, rozprowadzić komórki na płytkach agarowych LB-ampicyliny zawierających 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozyd (X-gal, 80 μg/ml) i izopropylo-1-tio-β-D-galaktopyranozyd (IPTG, 20 mM) (patrz tabela materiałów). Zaszczepić 50 ml kultur komórkowych pojedynczą kolonią przekształconych komórek E. coli w celu oczyszczenia zmutowanego plazmidowego DNA do analiz. Mutagenezę potwierdza się przez sekwencjonowanie DNA w zewnętrznej placówce.
6. Ekspresja i oczyszczanie białek
- W przypadku hodowli na dużą skalę należy zaszczepić niewielką ilość LB (zawierającej ampicylinę) pojedynczą kolonią z przekształconej płytki.
- Używając kultury nocnej, zaszczepić kulturę ekspresyjną dodatkami, takimi jak 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 i 20 mM glukozy, rozcieńczając kulturę nasion do 1/100.
- Hodować komórki, energicznie wstrząsając w temperaturze 37 °C. Hodować komórki do Abs 600 nm między 0,4-0,6 (środkowa faza logarytmiczna) przed schłodzeniem komórek do 20 °C. Indukować za pomocą 1 mM IPTG i rosnąć przez noc.
- Następnie zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
- Zawiesić osad komórkowy w buforze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie odwirować przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić pozostały osad w 10 ml buforu do lizy i inkubować zawiesinę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
nuta: Skład buforu do lizy: (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 2% Triton-X 100, 500 ng/ml lizozymu, 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 1 mM ditiotreitolu, 1 mM MgCl2, pH 8, patrz tabela materiałów).
- Mieszaninę należy poddać dwóm cyklom zamrażania i rozmrażania (-80 °C). Oddzielić frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przeanalizować je za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), w szczególności dodecylosiarczanu sodu (SDS)-PAGE (Rysunek 1B, C).
nuta: Komórki mogą być lizowane na kilka sposobów, takich jak zamrażanie i rozmrażanie, sonikacja, homogenizacja, liza enzymatyczna lub kombinacja tych metod. Oczyszczanie z ciał inkluzyjnych jest zalecane w celu uzyskania wysokiej wydajności białka.
- Oczyść białka za pomocą chromatografii kolumnowej Ni-NTA (patrz tabela materiałów). Załadować frakcję rozpuszczalną do zregenerowanej kolumny perełkowej Ni-NTA (1 ml/min). Umyj układ buforem TBS (50 mM Tris, 150 mM chlorku sodu, pH 7,5) przed rozpoczęciem gradientu (0-100% 500% imidazolu w TBS przez 60 min) i zbieraniem frakcji (1 ml/min). Dializować oczyszczone białka w celu charakterystyki biochemicznej w stosunku do 100 mM PBS (Figura 1C, D).
- Alternatywnie, użyj żelu powinowactwa His-Select Ni2+ (patrz tabela materiałów) w probówkach o pojemności 14 ml, aby związać i ponownie zawiesić rekombinowany CV-N wyrażony przez niego w roztworach buforowych z odpowiednio 20 mM imidazolem i 250 mM imidazolem. Inkubować partiami przez co najmniej 30 minut.
nuta: Zastosuj te częściowo oczyszczone białka do jednorazowej, wstępnie zapakowanej kolumny w celu wymiany buforu i oczyszczenia próbek biologicznych, na przykład węglowodanów i białek, które mogą załadować 1-1,5 ml eluatu z chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali.
- Przenieść roztwory białkowe do probówek wirówkowych z filtrem odcinającym o sile 10 kDa (patrz tabela materiałów) i zagęścić je przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 4 500 x g i w temperaturze 4 °C. W przypadku pomiarów SPR roztwory analitu należy wymienić na 10 mM HEPES, 150 mM chlorku sodu, 3 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), patrz tabela materiałów).
- Dodać ten bufor SPR do współczynnika rozcieńczenia 1:10 i odwirować czterokrotnie do objętości początkowej przez 10 minut w temperaturze 4 500 x g i w temperaturze 4 °C.
- Oznaczyć stężenie białka przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis NanoDrop (patrz tabela materiałów) w oparciu o obliczony współczynnik ekstynkcji (20,440 M-1 cm-1) dla głównego białka CVN2L0 o wielkości 23,474 Da. Użyć PBS (100 mM, pH 7,0) lub buforu SPR jako ślepej próby i zmierzyć stężenie białka w trzech etapach rozcieńczania (1:1, 1:10 i 1:100).
7. Spektroskopia SPR
- Jako bufor regeneracyjny należy stosować dwukanałowy system SPR (patrz tabela materiałów) z pracującym buforem HBS-EP(+) i 10 mM glicyny HCl o pH 1,5-1,6. Włącz urządzenie, odgazowywacz, automatyczny sampler i pompę, a następnie umyj cały system za pomocą ddH20 przez 1 godzinę. Umieść gotowy do użycia bufor do biegania w osobnej butelce.
- Upuść olejek immersyjny na detektor i zamontuj szklany chip czujnika (patrz Tabela materiałów) pokryty cienką złotą folią i na górnej stronie funkcjonalizowany hydrożelem karboksymetyodekstranu bezpośrednio na detektorze poniżej trzyportowej komory przepływowej. Napraw ustawienie, pociągając w dół handling.
nuta: C19RBDHC30M 200 nm derywatyzowany hydrożel karboksymetylodekstranowy streptawidyny o średniej gęstości biotynylowanego białka RBD koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, jest gotowym do użycia chipem czujnikowym ze wstępnie unieruchomionym ligandem.
8. Test wiązania SPR dla wiązania CV-N z białkiem HA, S i RBD
- Unieruchomić ligandy białkowe na chipach czujnika, wykonując poniższe czynności.
- Otwórz tabelę uruchamiania, klikając Formularz na pasku menu i Uruchom Edytor tabel w zintegrowanym oprogramowaniu SPRAutoLink (patrz Spis materiałów). Wybierz i kliknij BASIC_Immobilization z listy dostępnych tabel uruchamiania i postępuj zgodnie z instrukcjami procedury eksperymentalnej na ekranie komputera. Odpowiedni używany edytor próbek jest pokazany w prawym górnym rogu.
- Kliknij na Edytor zestawu próbek w sekcji Formularz, aby wypełnić listę odczynników dla dwóch stojaków umieszczonych w autosamplerze w celu dalszych analiz. Kliknij Autosampler Direct Control jako "Narzędzie" na pasku menu, aby przesunąć stojaki do przodu lub do tyłu. Jako temperaturę roboczą wybierz 4 °C.
nuta: Oprogramowanie SPR pozwala na "SPR Instrument Direct Control" i "Pump Direct Control" poprzez wybór odpowiednich narzędzi, a także obsługę automatycznego podajnika próbek i kliknięcie na Formularz; Do przeprowadzenia analizy danych można również wybrać opcję Uruchom edytor tabel, Wykres danych lub Przetwarzanie końcowe. Pliki są zapisywane bezpośrednio w katalogu domyślnym i eksportowane jako scrubber.files z okna Post-Processing.
- Uruchom pompę, aby zainparować ddH20 klikając Narzędzia i Pump Direct Control i zapisz dane klikając na SPR Instrument Direct Control i za każdym razem Start w nowo pojawiających się oknach. Umieść odczynniki sprzęgające (krok 8.3) w fiolkach o pojemności 300 μl, umieść je w stojakach automatycznego podajnika próbek i uruchom tabelę przebiegów, klikając Run.
nuta: Powierzchnie wiórów są kondycjonowane 10 mM buforem glicyny o pH 9,0 lub mogą być przepłukiwane 1 M chlorkiem sodu, 0,1 M buforem boranu sodu o pH 9,0 w celu kondycjonowania powierzchni chipa z derytylu karboksylu do mieszanki aktywacyjnej EDC/NHS.
- Do tej prostej interakcji białko-białko użyj chipa CMD500D (patrz Tabela materiałów), aby wygenerować jednostkę mikroindeksu załamania światła (μRIU) = 2500 - 3000 komora przepływowa z unieruchomionym HA i μRIU = 400 komórka przepływowa z białkiem kolca. Przy natężeniu przepływu wlewu wynoszącym 15 μl/min wstrzyknąć wodną i równą mieszaninę 0,4 M chlorowodorku N-etylo-N'-(dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC*HCl) i 0,1 M N-hydroksysukcynimidu (NHS), wykonując następujące sekwencje.
- Napełnij pompę z prędkością 25 000 μl/min, wykonaj regulację linii bazowej przez 30 s, wstrzyknij 90 μl roztworu aktywującego próbkę (EDC/NHS) przez 6 minut kontaktu, a następnie przytrzymaj przez kolejne 5 minut.
- Powtórz ten cykl po linii bazowej, biegnąc przez 1 minutę z prędkością 10 μl/min tylko na lewej komórce przepływowej (niebieskiej), aby wstrzyknąć i unieruchomić chemicznie syntetyzowane peptydy, HA i białko kolca przy 20 μg/ml i pozwolić na późniejszą korektę linii podstawowej za pomocą ddH2O przez 1,5 minuty przed wygaszeniem aktywowanej powierzchni chipa 1 M etanoloaminą HCl pH 8,5.
- Przenieść probówki z próbnika cieczy do odgazowywacza z ddH20 do butelki z HBS-EP(+) (Rysunek 2).
- Przeanalizuj sensorgramy SPR.
- Do wykonania badań kinetycznych należy stosować różne stężenia analitu (10-5-10-8 M), z etapem regeneracji po każdym wstrzyknięciu i ślepymi pomiarami po różnych analitach. Zmienić natężenie przepływu na 10 μl/min i rozpocząć iniekcję na 4 minuty kontaktu, następnie 5 minut generowania linii podstawowej i dwa etapy regeneracji po 2 minuty każdy w odstępie 30 s.
- Wstrzyknąć roztwór buforowy do ślepych pomiarów, których sensorgramy są odejmowane od serii próbek w celu normalizacji różnych stężeń białka.
- Kliknij Formularz, przewiń w dół i przejdź do "Przetwarzanie końcowe", klikając ten tryb operacji. Kliknij przycisk Dodaj, aby wybrać krzywe wiążące wygenerowane w czasie w formularzu wykresu danych dla każdej komórki przepływu i wyeksportować nakładkę jako plik suwaka (.ovr). Kliknij Plik, aby otworzyć opcje zapisywania plików. Krzywe odpowiedzi można uzyskać, wyrównując krzywą lewą i prawą oraz odejmując sygnały drugiego kanału odniesienia od sygnałów kanału liganda.
nuta: Dane są obsługiwane w "Post-Processing" poprzez obliczeniowe definiowanie sensorgramów. Jest on umieszczany w nakładce sensorgramów z lewej i prawej komórki przepływowej lub reprezentowany jako sensorgramy z różnicy obu kanałów.
- Oczyść całą fluidykę za pomocą 50-100 mM buforu glicyny o pH 9,5, wody i 20% etanolu przed i po pomiarach wiązania, aby usunąć ślady soli lub jakiegokolwiek zanieczyszczenia białkami, lub bardziej rygorystycznie, z 0,5% SDS i glicyną.
nuta: Aby zapobiec uszkodzeniu instrumentu, zaleca się sprawdzenie stabilności mechanicznej szklanego chipa przed ponownym włożeniem wkładu z chipem do instrumentu, jeśli wióry były przechowywane w buforze lub przy 100% wilgotności.
Tabela 1: Dane kinetyczne uzyskane z sensorgramów SPR dla wiązania CVN2L0 i wariantów wiązania Cys-Cys V2, V4 i V5 z HA przy użyciu modelu wiązania Langmuir 1:1. KD [M] = kwył./kwłączony lub kd/ka. Wszystkie dane są generowane w temperaturze 25 °C w buforze HBS-EP(+).
powiedział:
| Analit | kna [M-1*s-1] | Kwył. [S-1] | KD |
| Kod CVN2L0 | 5.1 O3 | 1.3 E-3 | 255 nM |
| Wersja 2 | 4.0 O3 | 1.1 e-3 | 275 nM |
| Wersja 4 | 1.2 O3 | 1.3 E-3 | 11 μM |
| Wersja 5 | 1.2 O3 | 5.8 E-2 | 5 μM |
