Magnetyczny rezonans jądrowy do badania oddziaływań białko-białko na poziomie atomowym

Streszczenie

Źródło: Winkelaar, G., et al. Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST). J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego do badania interakcji białko-białko pomiędzy ¹⁵znakowanymi N dzikimi i zmutowanymi białkami envoplakiny a nieznakowanym białkiem wimentyny. Udana interakcja między envoplakiną typu dzikiego a wimentyną prowadzi do rozległego poszerzenia linii i zaniku pików w widmach NMR, podczas gdy brak interakcji między zmutowaną envoplakiną a wimentyną skutkuje dobrze rozdzielonymi pikami w widmach NMR.

Protokół

1. Metody NMR

1. Przygotowanie próbki NMR
   1. Oczyść ¹⁵białek typu dzikiego lub R1914E E-PRD znakowanych N za pomocą 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7. Roztwory białkowe zwykle wahają się od 0,3 do 1 mM przy objętościach około 1 ml.
      nuta: Białko można zagęścić do >100 μM za pomocą odśrodkowego urządzenia ultrafiltracyjnego MWCO o masie 3 kDa, 5 ml, aby doprowadzić stężenie do odpowiedniego zakresu do przygotowania próbki.
   2. Oczyść próbkę nieznakowanego białka VimRod za pomocą 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7.
   3. W końcowej objętości 500 μl dodać białko E-PRD typu dzikiego lub zmutowanego do końcowego stężenia 100 μM, tlenek deuteru (_D2O) do końcowego stężenia 10% (v/v) i DSS (kwas 4,4-dimetylo-4-silapentano-1-sulfonowy) do końcowego stężenia 20 μM. Doprowadzić objętość próbki do 500 μL za pomocą 20 mM Tris-HCl, 1 mM naziemna telewizja cyfrowa i pH 7. Przygotowanie reprezentatywnej próbki opisano w tabeli 1.
      nuta: Rezonans 0 ppm DSS służy do kalibracji przesunięć chemicznych ¹H, jak również do pośredniego odniesienia do ¹⁵N przesunięć chemicznych białka. D₂O jest używany do sygnału blokady deuteru, aby spektrometr działał przy stałym polu magnetycznym netto.
   4. Uzupełnić drugą próbkę E-PRD,_D2Oi DSS, jak w poprzednim kroku, i dodać VimRod do końcowego stężenia 50 μM przed doprowadzeniem objętości do 500 μL.
   5. Przenieś próbki o objętości 500 μl do probówek NMR o szerokości 5 mm na potrzeby eksperymentu.

2. Konfiguracja eksperymentalna NMR

1. Włącz przepływ powietrza za pomocą polecenia eject "ej"; spowoduje to podniesienie próbki z magnesu. Teraz umieść próbkę w kołpaku na magnesie przy otworze i włóż ją za pomocą polecenia "ij". Zanim przejdziesz dalej, poczekaj, aż próbka osiądzie w magnesie.
2. Utwórz nowy zestaw danych za pomocą polecenia "edc" i załaduj standardowe parametry ¹H NMR, wybierając eksperyment "ZGPR" (Rysunek 1). Wypełnij pola NAME, EXPNO (numer eksperymentu) i PROCNO (numer folderu przetwarzanych danych). Wybierz rozpuszczalnik w polu "Ustaw rozpuszczalnik" i kliknij "Wykonaj 'getprosol'", aby odczytać standardowe parametry głowicy sondy i zależne od rozpuszczalnika (prosol).
3. Zablokować próbkę w deuterowanym rozpuszczalniku, tj. D₂O, za pomocą polecenia "zablokować" i poczekać, aż zakończy zamiatanie i osiągnie blokadę.
4. Skoryguj częstotliwość rezonansową magnesu, dostrajając próbkę za pomocą automatycznego polecenia strojenia "atma". Monitoruj krzywą chybotania, aż do zakończenia automatycznego strojenia.
5. Podkładka pod pole magnetyczne za pomocą TOPSHIM (polecenie "topshim"). Shimming to proces dostosowywania pola magnetycznego w celu uzyskania jednorodności wokół próbki. Dobrą praktyką jest przechowywanie wartości podkładek za pomocą polecenia "wsh" i odczytywanie ich za pomocą "rsh" przed topshim, jeśli używasz tych samych lub podobnych próbek.
6. Dostosuj wzmocnienie odbiornika za pomocą polecenia "rga", aby osiągnąć maksymalny stosunek sygnału do szumu.
7. Umieść środek widma na przesunięciu rezonansu wody (o1) i ustaw 90-stopniowy impuls protonowy (p1) na wysoką moc za pomocą "calibo1p1".
8. Zbierz widmo protonów za pomocą polecenia zero go "zg" i przetwarzaj z "efp", który obejmuje mnożenie wykładnicze ("em"), rozpad indukcji swobodnej (FID) obejmujący poszerzenie linii, transformację Fouriera FID "ft" i "pk" w celu zastosowania korekcji fazy.
9. Zastosuj automatyczną korekcję fazy "apk" i automatyczną korektę linii bazowej "absn" przy użyciu opcji wielomianu bez całkowania.
10. Utwórz nowy zestaw danych (jak w wersji 1.2.2) dla eksperymentu SOFAST HMQC, wybierając pozycję "SFHMQC3GPPH" w eksperymencie.
11. Skopiuj zoptymalizowane P1 i O1 z widma protonów i wypełnij impulsy zależne od P1 za pomocą polecenia "getprosol 1H p1 plw1", gdzie p1 to zoptymalizowana wartość P1, a plw1 to poziom mocy dla P1.
12. Zoptymalizuj stałą CNST54, aby ustawić przesunięcie chemiczne amidu, a CNST55 zdefiniuj szerokość pasma w celu objęcia obszarów widmowych będących przedmiotem zainteresowania, co pozwala na optymalizację wzmocnienia odbiornika (ilustracja 2). Aby wybrać te parametry, wyodrębnij pierwszy FID (rozpad swobodnej indukcji) z widma dwuwymiarowego i poszukaj obserwowanego sygnału, aby je zdefiniować. Ponadto zmieniaj opóźnienie relaksacji (D1), liczbę skanów (NS) i skanowania fikcyjne (DS), aby uzyskać akceptowalną czułość sygnału za pomocą polecenia "gs", które umożliwia go i skanowanie w celu monitorowania jakości danych w czasie rzeczywistym.
13. Zapisz widma za pomocą Zero Go "zg".

Tabela 1. Przygotowanie próbki NMR.

Rozdział Rozdział Rozdział szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział szt. szt.

próbka	1 mM E-PRD w buforze A (μL)	1mM VimRod w buforze A1 (μL)	Bufor A (μL)	200 μM DSS w D2O (μL)	Bufor B2 (μL)	Całkowita objętość (μL)
Sam E-PRD	50	0	50	50	350	500
E-PRD + VimRod	50	50	0	50	350	500
1Bufor A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2Bufor B: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7

Wyniki

Rysunek 1: Zrzut ekranu przedstawiający konfigurację eksperymentu NMR. Pokazane okno służy do konfigurowania standardowego eksperymentu w celu zebrania zestawu danych HSQC. Parametry eksperymentu są odczytywane obok elementu Eksperyment. Pokazany eksperyment ZGPR został wybrany jako wstępny eksperyment w celu obciążenia standardowych i zależnych od rozpuszczalnika parametrów protonu. Okno Tytuł służ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek amonu (15N, 99%)	Laboratoria Izotopowe w Cambridge	NLM-467	Oznaczanie izotopów dla NMR
D2O, Tlenek deuteru (D, 99,8%)	Laboratoria Izotopowe w Cambridge	DLM-2259	Przygotowanie próbki NMR
DSS, 2,2-dimetylo-2-silapentano-5-sulfonian sodu, D6 (D,98%)	Laboratoria Izotopowe w Cambridge	DLM-8206	Odniesienie do NMR
Precyzyjne rurki NMR 5 mm, długość 7"	SJM/Deuterotubes	BOROECO-5-7	Probówki NMR
Spektrometr NMR (14,1 Tesli)	Bruker		Akwizycja danych NMR
Sonda kriogeniczna TCI 5mm z-PFG	Bruker		Akwizycja danych NMR
oprogramowanie
Bruker TopSpin 4.0.1	Bruker		Przetwarzanie danych NMR

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: