Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do wyboru białek o wysokim powinowactwie do białka docelowego

Streszczenie

Źródło: Zhang, W., et al., Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulatory for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie demonstrujemy technikę wyświetlania fagów w celu wyizolowania wstępnie zaprojektowanych fagów wyrażających białka o wysokim powinowactwie do docelowego białka.

Protokół

1. Przygotuj bibliotekę fagów

1. Rozmrozić bibliotekę fagów na lodzie i rozcieńczyć ją do 100-krotności różnorodności biblioteki w PBS. Na przykład, jeśli różnorodność biblioteki wynosi 1 x 10¹⁰, a stężenie biblioteki wynosi 1 x 10¹³, rozcieńcz bibliotekę tak, aby stężenie wynosiło 1 x 10¹². W przypadku używanych tutaj bibliotek należy je rozcieńczyć 10-krotnie w PBS, łącząc 1 ml biblioteki z 9 ml PBS.
   nuta: Różnorodność bibliotek powinna była zostać określona na etapie tworzenia biblioteki i nie może być łatwo oceniona w inny sposób. Stężenie w bibliotece można określić poprzez inokulację komórek E. coli w środkowej fazie logarytmicznej (OD600 0,6 - 0,8) i posiewanie na LB/carb.
2. Dodać 1/5 objętości PEG/NaCl. Na przykład dla 10 ml wcześniej rozcieńczonej biblioteki dodaj 2 ml PEG/NaCl.
3. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
4. Wirować przy 11 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie odwirować przez 2 minuty, aby usunąć pozostały supernatant.
   nuta: Umieść rurkę w wirniku w tej samej orientacji po raz drugi, ponieważ jako pierwsza utrzymywała pelety w tym samym miejscu, dzięki czemu łatwiej ją zobaczyć.
5. Delikatnie zawiesić osad faga w 1 ml PBT na białko. W przypadku czterech białek ponownie zawiesić osad w 4 ml PBT.
   nuta: Staraj się nie dotykać pelletu i nie wprowadzaj pęcherzyków powietrza.

2. Wyświetl do docelowego białka (białek)

1. Opcjonalna kontrola: Dodać 100 μl biblioteki fagów do każdej powlekanej studzienki na płytce kontrolnej. Inkubować w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min i przenieść bibliotekę z płytki kontrolnej na płytkę docelową.
2. Usunąć bufor PB z płytki docelowej i dodać 100 μl biblioteki fagów do każdej powlekanej studzienki.
3. Inkubować w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.

3. Elute wokół jednego faga

1. Usunąć bibliotekę fagów i przemyć powlekane studzienki czterokrotnie buforem PT. Odwróć talerz i postukaj w ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie krople.
   nuta: Jeśli wiele białek docelowych jest pokrytych na jednej płytce, staraj się zminimalizować przepływ wszystkich kolejnych roztworów między studzienkami.
2. Dodać 100 μl 0,1 M HCl do każdej pokrytej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.
3. Zneutralizować pH, dodając 12,5 μl 1 M Tris-HCl (pH 11) do każdej powlekanej studzienki.
4. Zebrać wymyte fagi ze wszystkich 8 dołków w jednej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Pipetować w górę i w dół podczas przenoszenia, aby roztwory były jednorodne i odessać cały płyn z dołków.
5. Dodać 10% BSA do połączonego eluowanego faga do końcowego stężenia 1%. Aby uzyskać typową okrągłą objętość elucji wynoszącą 950 μl, dodaj 95 μl 10% BSA. Przechowywać w temperaturze 4 °C. To jest okrągłe pierwsze wyjście.

4. Przygotowanie do kolejnych rund selekcji

1. Przygotować kulturę nasion do hodowli faga wejściowego do następnej rundy selekcji, jak w kroku 1.1.
2. Pokryj płytkę do trzeciej rundy selekcji, jak w kroku 1.2, zmianami opisanymi poniżej.
   1. Pokryj tylko cztery dołki na białko w 96-dołkowej płytce wiążącej. Do odpowiedniej rundy należy użyć połowy zawartości probówek "round 2/3" lub "round 4/5". W razie potrzeby rozcieńczyć zawartość tych probówek, aby uniknąć osadzania się białek w roztworze.
3. Przygotuj dane wejściowe faga do następnej rundy selekcji.
   1. Użyj połowy jednego okrągłego wyjścia, aby zaszczepić 3 ml komórek środkowej fazy logarytmicznej. Aby uzyskać typową rundę z jednym wyjściem, zaszczepić 500 μl produktu.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.
   3. Dodać pomocniczy M13K07 do końcowego stężenia 1 x^{10 10} PFU/ml.
   4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.
   5. Przenieś całe 3 ml kultury do 30 ml 2YT/carb/kan. Rośnie przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterylny, 96/stojak, 10 Stojaki/opakowanie)	Fisher Naukowy	14-222-198	Wyroby z tworzyw sztucznych
Odwodnione podłoża hodowlane BD Difco: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Naukowy	DF0446-17-3	Przygotowanie płytek do miareczkowania
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V	BioShop Kanada	ALB001	Składnik bufora
Sól disodowa karbenicyliny 89,0-100,5% bezwodna	Millipore-Sigma	Zobacz materiał C1389-5G	Hodowla komórek zakażonych fagami
Kompaktowa cyfrowa wytrząsarka do mikropłytek	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 11-676-337	urządzenie
Corning Microplate Aluminiowa taśma uszczelniająca	Fisher Naukowy	07-200-684	Uszczelnianie zapasów glicerolu fagowego
Odwodniony agar	Fisher Naukowy	DF0140-01-0	Przygotowanie płytek do miareczkowania
DS-11 Spektrofotometr/Fluorometr	DeNovix powiedział:	DS-11 FX+	urządzenie
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, nieobrobiona, mikropłytka z dnem w kształcie litery U	Fisher Naukowy	7000133	Wyroby z tworzyw sztucznych
kwas solny	Fisher Naukowy	A144-500	chemiczny
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemicznie kompetentny E. coli	Fisher Naukowy	C854003	Szczep bakteryjny do infekcji fagowej
Siarczan kanamycyny	Fisher Naukowy	AAJ1792406	Hodowla komórek pomocniczych zakażonych fagami M13K07
Fage pomocniczy M13KO7	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	N0315S	Zezwolenie na pakowanie i wydzielanie fagów
MaxQ 4000 Wytrząsarka orbitalna	Fisher Naukowy	11-676-076	urządzenie
Nunc MaxiSorp 96-dołkowa mikropłytka, płaskie dno	Technologie życiowe	Numer telefonu 44-2404-21	Wyroby z tworzyw sztucznych
Roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 10X	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP3994	Składnik buforowy/pożywka do resuspensji fagów
Folie poliestrowe do testu ELISA i inkubacji	Firma VWR	Nr kat. 60941-120	Pokrywanie mikropłytek podczas inkubacji
Glikol polietylenowy 8000 (PEG)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP233-1	Wytrącanie fagów
chlorek sodu	Millipore-Sigma	S3014	Wytrącanie fagów
Sterylne plastikowe probówki hodowlane: półprzezroczysty polipropylen	Fisher Naukowy	14-956-1D	Hodowla danych wejściowych fagów
Chlorowodorek tetracykliny	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP912-100	Hodowla komórek E. coli OmniMax
Baza Tris	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1525	Neutralizacja eluowanego roztworu fagowego
Trypton w proszku	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1421-2	Składnik pożywki do wzrostu komórek
Animacja 20	Fisher Naukowy	BP337500	Składnik bufora
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1422-2	Składnik pożywki do wzrostu komórek