1. FKBP12 F36V -mVenus Oczyszczanie
- Transformacja (DE3) komórek pLysS z wektorem pET22b zawierającym monomeryzowane FKBP12F36V12 ludzkie oraz N-końcowe znaczniki His6 i mVenus (wektor dostępny na życzenie). Płytki na agarze LB uzupełnione 50 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu.
- Przenieść przekształcone kolonie do 100 ml kultury starterowej LB i rosnąć przez 16 - 20 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
- Rozcieńczyć gęstą kulturę starterową (OD600 >1) w stosunku 1:100 w podłożu LB (2 x 500 ml partie) i rosnąć przez 2 - 3 godziny do OD600 = 0,6 - 0,8 (37 °C, 200 obr./min).
- Fajne kultury na lodzie. Indukować za pomocą 250 μM IPTG i rosnąć przez 16 - 20 godzin w temperaturze 21 °C, 200 obr./min.
- Zbieraj komórki przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 20 minut.
- Zawiesić osad w 40 ml buforu A IMAC (20 mM fosforanu sodu o pH 7,5, 500 mM NaCl, 3 mM imidazolu, 1 mM β-merkaptoetanolu) uzupełnionego inhibitorami proteazy wolnymi od EDTA (1 tabletka na komórkę).
- Sonikować komórki (500 watów, 20 kHz, amplituda 40%, 9 s wł., 11 s wyłączone na 15 min) na lodzie i zebrać rozpuszczalny materiał przez odwirowanie przy 20 000 x g.
- Przenieść rozpuszczalny lizat do kolby stożkowej i dodać 2 ml żywicy (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 1 godzinę z obrotem 105 obr./min
nuta: Sefaloza niklowa może być również wykorzystana do tego etapu IMAC.
- Zebrać żywicę i przemyć 250 ml buforu A IMAC, a następnie 500 ml buforu B IMAC (20 mM fosforanu sodu pH 7,5, 500 mM NaCl, 7 mM imidazolu, 1 mM β-merkaptoetanolu).
nuta: Zwiększ do 50 mM imidazol w przypadku stosowania żywicy sefarozy niklowej.
- Elute białko znakowane His6 za pomocą buforu C IMAC (20 mM fosforan sodu pH 7,5, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 1 mM β-merkaptoetanol).
- Wstrzyknąć do kolumny wykluczającej wielkość (patrz tabela materiałów) zrównoważonej w 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl i 1 mM DTT. FKBP12F36V ma swoją szczytową elucję przy 87,71 ml na użytej przez nas kolumnie.
- Oceń czystość za pomocą SDS-PAGE i połącz i skoncentruj zgodnie z wymaganiami.
2. Przygotowanie tablicy płyt wielodołkowych
- Rozmrozić oczyszczony FKBP12F36V (lub znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania) w temperaturze od -80 °C.
- Przygotować roztwór 100 nM oczyszczonego FKBP12F36V (pożywka, 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Sonikacja i wirowanie (szybkie wirowanie 13 000 obr./min), aby zapobiec tworzeniu się agregatów.
- Pipetę 100 - 200 μL do 8-dołkowej komory obserwacyjnej ze szklanym dnem.
- Dodać ściemniacz BB do końcowych stężeń 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 i 500 nM.
- Jako odniesienie przygotuj roztwór 100 nM samego mVenus, aby ocenić potencjalne efekty agregacji i opadów oraz odzyskać wartość jasności monomeru przy tych samych ustawieniach akwizycji.
3. Akwizycja konfokalna bez kalibracji
- Uruchom system konfokalny (rysunek 1). Działałby każdy system konfokalny mikroskopu skaningowego ze światłem wyposażony w detektory cyfrowe lub dobrze scharakteryzowane detektory analogowe i zdolny do utrzymywania stałego czasu przebywania dla każdego uzyskanego piksela.
- Ustaw ścieżkę wiązki wzbudzenia:
- Włącz laser 514 nm i ustaw go na moc 20 - 100 nW na wyjściu z obiektywu (dla FKBP12F36V-mVenus).
- Wybierz obiektyw 63X1.4NA lub obiektyw z korekcją kołnierza do zanurzenia w wodzie przeznaczony do FCS.
- Włącz jeden detektor HyD, APD lub skalibrowany PMT. Preferowane są detektory zdolne do zliczania fotonów, ponieważ w tym przypadku obliczanie S, przesunięcia i σ02 nie jest konieczne.
- Wybierz okno emisji od 520 do 560 nm
- Ustawić otwór na 1 jednostkę Airy dla odpowiedniej emisji ~545 nm.
- Ustaw tryb akwizycji na 16 x 16 pikseli
- Ustaw czas zatrzymania piksela tw taki sposób, aby spełniał tklatki >> TD >> t zatrzymania, gdzie TD jest czasem przebywania białka dyfuzyjnego, a tklatka jest liczbą klatek na sekundę. Odpowiadało to ustawieniu czasu przebywania na ~13 μs.
nuta: Niektórzy producenci komercyjni mieli skanery, które nie utrzymywały stałego czasu przebywania na piksel. Ta stałość jest kluczowa, aby metoda działała.
- Ustaw rozmiar piksela na ~120 nm.
- Wybierz tryb akwizycji xyt i wybierz liczbę klatek, które mają zostać pozyskane na akwizycję i studnię (na przykład 5,000).
- Jeśli system jest wyposażony w tryb wysokiej przepustowości, wprowadź współrzędne każdego odwiertu i liczbę akwizycji na odwiert, aby zautomatyzować proces.
nuta: Uważaj, aby upewnić się, że jest obecny dystrybutor wody, jeśli używasz obiektywu zanurzeniowego.
- Jeśli system jest wyposażony w system perfuzyjny, załaduj roztwór BB i zaprogramuj perfuzję tak, aby rozpoczynała się zaraz po 5000klatce, aby ocenić kinetykę dimeryzacji podczas uzyskiwania np. 10 000 obrazów.
- Dodaj kroplę oleju do obiektywu zanurzeniowego w oleju/wody, jeśli używasz obiektywu do zanurzenia w wodzie z korekcją kołnierza przeznaczonego do FCS.
- Zamontuj 8-dołkową komorę obserwacyjną na scenie.
- Wybierz odpowiednią studnię i skup się na rozwiązaniu.
nuta: WAŻNE: Unikaj ustawiania ostrości blisko dolnej szyby, aby uniknąć odbicia i rozproszenia. Podczas ustawiania ostrości głębiej na rozwiązaniu odłącz opcję automatycznego ustawiania ostrości.
- Rozpocznij pobieranie i zapisz wynikowy stos obrazów w formacie TIFF.
4. Detrend i analiza jasności przy użyciu pakietu R nandb
- W ramach wstępnej kontroli jakości przetwarzania użyj narzędzia ImageJ, aby przyjrzeć się obrazom i przywrócić profil intensywności, jak pokazano na rysunku 2a. Jest to przydatne do określenia, czy wystąpiło zbyt dużo fotowybielania. Jeśli bielenie jest zbyt duże, dane nie nadają się do dalszej analizy.
nuta: ImageJ może być również przydatny do konwersji obrazów do TIFF z formatów komercyjnych. Opisane poniżej oprogramowanie nandb może pracować tylko z plikami TIFF.
- Pobierz i zainstaluj języki R i RStudio. Najlepiej jest najpierw pobrać i zainstalować R, a następnie RStudio.
nuta: Poniżej znajduje się opis, jak korzystać z pakietu nandb R. Znajomość języka R nie jest wymagana do korzystania z nandb, jednak ułatwi życie.
- Zainstaluj pakiet nandb.
- Otwórz program RStudio i w konsoli wpisz install.packages("nandb") i poczekaj na instalację.
- Poznaj nandb
- Review instrukcja.
- Zapoznaj się z wbudowaną pomocą programu RStudio, aby uzyskać informacje o różnych funkcjach. Najbardziej prawdopodobną funkcją, która zostanie użyta, będzie brightness(). Wyświetl plik pomocy dla tej funkcji, wpisując ? brightness() na konsoli.
- Obliczanie jasności
- Powiedzmy, że na pulpicie znajduje się plik obrazu o nazwie img001.tif (zauważ, że "nandb" działa tylko z plikami TIFF). Można obliczyć jasność tego obrazu:
b <- jasność("~/Pulpit/img001.tif", tau = "auto")
- Spowoduje to przypisanie jasności obrazu do zmiennej b w R. Tau = "auto" zapewnia, że obraz jest prawidłowo detrendowany przed obliczeniem jasności. Najczęstszą czynnością, którą należy wykonać z tego miejsca, jest obliczenie średniej lub mediany jasności obrazu. Można to zrobić, wpisując średnią(b) lub medianę(b). Można również zapisać obraz jasności na pulpicie za pomocą
ijtiff::write_tif(b, "~/Pulpit/whatever_img_name")
- Załóżmy, że na pulpicie znajduje się folder pełen obrazów, images_folder i trzeba obliczyć jasność tych obrazów i zapisać obrazy jasności jako pliki TIFF. Następnie zobacz ?brightness_folder(). Ta funkcja przetwarza cały folder jednocześnie:
brightness_folder("~/Pulpit/images_folder", tau = "auto")
Jest to szczególnie dobre dla tych, którzy mają oprogramowanie, które wolą od R, ponieważ wszystkie pliki są przetwarzane w jednym poleceniu, a następnie można kontynuować pracę z obrazami TIFF o jasności wyjściowej w wybranym oprogramowaniu, czy to ImageJ, Python, czy coś innego.
