$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Klonowanie
- Określ konfiguracje do sklonowania i wybierz konsolidator. Oznacz białka fragmentami na końcu N lub C, jak opisano poniżej, aby nie zakłócały ich prawidłowej lokalizacji. Użyj elastycznego konsolidatora, takiego jak (GGGGS)x2.
- Genetycznie znakuj białka będące przedmiotem zainteresowania fragmentami PAmCherry1. Jako jedną z opcji użyj plazmidów klonujących wymienionych na liście materiałów zawierających fragmenty RN (reszty PAmCherry1 1-159) i RC (Met plus reszty PAmCherry1 160-236) z flankującymi sekwencjami MCS.
- Linearyzuj plazmidy zawierające fragmenty RN i RC za pomocą odwrotnego PCR (lub trawienia restrykcyjnego) w miejscu insercji. Startery do odwróconej reakcji PCR wymieniono w Tabeli 1. Poniżej znajduje się przykładowy protokół PCR używany w laboratorium autora (zobacz Lista materiałów, aby zapoznać się z dokładnymi materiałami użytymi w tym protokole).
- Wymieszać ze sobą reakcję PCR, doprowadzając do końcowej objętości 50 μl z wodą: do cienkościennej probówki PCR dodać wodę, 25 μl 2x mieszanki wzorcowej, po 0,5 μl każdego ze starterów do przodu i do tyłu (20 μM rozcieńczony bulion, 0,2 μM stężenie końcowe) i 1 ng matrycy. Stosować następujące warunki cyklu: 98 °C przez 30 sekund, 30 cykli w temperaturze 98 °C przez 7 sekund i 68 °C przez 2 minuty oraz końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
- PCR geny będące przedmiotem zainteresowania do insercji do zlinearyzowanych plazmidów zawierających fragmenty RN i RC. Przeprowadzić PCR jak w kroku 1.2.1 z czasem wydłużenia w temperaturze 68 °C. Użyć starterów z nawisami, które zawierają elastyczną sekwencję łącznika, taką jak GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT dla (GGGGS)x2 i homologia 15 par zasad do końców zlinearyzowanych plazmidów RN i RC w celu rekombinacji.
nuta: Zwisy starterów dla badanych białek przedstawiono w Tabeli 2 w przypadku użycia starterów z Tabeli 1 do linearyzacji szkieletu plazmidu.
- Strawić reakcję PCR za pomocą Dpn1, aby wyeliminować matrycę PCR. Dodać 0,5 μl Dpn1 (20 U/μl) bezpośrednio do 50 μl reakcji PCR. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i inaktywować termicznie w temperaturze 80 °C przez 20 minut. Jeśli szablon tła utrzymuje się w późniejszych krokach, zwiększ ilość enzymu lub wydłuż czas trawienia.
- Oczyść produkty PCR za pomocą kolumny wirowej zgodnie z opisem producenta.
- Wykonaj reakcję niezależną od ligacji, aby połączyć zlinearyzowany plazmid zawierający fragment RN lub RC z interesującym genem. Zmierzyć stężenie oczyszczonych produktów PCR: połączyć 50 ng zlinearyzowanego plazmidu i 50 ng interesującego genu z 1 μl premiksu enzymatycznego i doprowadzić całkowitą objętość do 5 μl za pomocą wody dejonizowanej. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 15 minut, umieścić na lodzie i dodać 20 μl buforu TE.
- Przekształć rekombinowane plazmidy w kompetentne bakterie.
- Wybierz 2-4+ (według uznania) kolonie do hodowli O/N. Dodać 5 ml bulionu LB i 5 μl kanamycyny (50 mg/ml bulionu) do 14 ml polipropylenowej probówki okrągłodennej i dodać wybraną kolonię bakterii za pomocą wysterylizowanej pętli zaszczepiającej. Inkubować w temperaturze 37 °C O/N, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.
- Zamrozić 1 ml kultury O/N na wywar glicerolowy i miniprzygotować pozostałą część zgodnie z opisem producenta.
- Wykonaj sekwencjonowanie, aby określić dobry klon. Jeśli używasz plazmidów klonujących z Listy Materiałów, użyj starterów M13 do przodu i do tyłu (w oddzielnych reakcjach), jeśli to konieczne, aby uzyskać pełną sekwencję konstruktu fuzyjnego. Porównaj z oczekiwaną sekwencją za pomocą narzędzia do wyrównywania, takiego jak BLAST z National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Przenieś zweryfikowane sekwencyjnie konstrukty do plazmidu ekspresyjnego poprzez reakcję rekombinazy.
- Dodać 75 ng docelowego plazmidu - takiego jak pcDNA do przejściowych transfekcji lub pLenti do pakowania lentiwirusa - i 50 ng rekombinowanego plazmidu klonującego do 1 μl premiksu enzymatycznego i zwiększyć całkowitą objętość do 5 μl za pomocą wody dejonizowanej. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę, następnie dodać 5 μl buforu TE.
nuta: Do pakowania lentiwirusa i stabilnego generowania linii komórkowych należy użyć innego plazmidu docelowego dla każdego konstruktu, na przykład jednego z opornością na puromycynę, a drugiego z neomycyną. Pozwala to na podwójną selekcję transdukowanych komórek. Należy również wziąć pod uwagę promotor dla każdego z nich, taki jak konstytutywny promotor wirusa cytomegalii (CMV) dla wysokich poziomów ekspresji lub CMV z operatorem TetO dla regulowanej ekspresji doksycykliny.
- Przekształć 5 μl w kompetentne bakterie i miniprzygotuj plazmidy, jak w krokach od 1.2.6 do 1.2.8, ale przy użyciu odpowiedniego antybiotyku (zwykle ampicyliny).
- Określ optymalną konfigurację BiFC.
- Plazmidy o ekspresji kotransfekcyjnej do komórek U2OS (lub komórki z wyboru).
- Dodaj 350 μl fenolu DMEM bez czerwieni i antybiotyków, uzupełnionego 10% FBS do każdej studzienki 8-dołkowego szkiełka z dolną komorą #1,5. Płytka około 7,5 x 104 komórki na studzienkę, tak aby komórki były około 70% -90% zlewające się następnego dnia.
- Dzień po posiewie, plazmidy ekspresyjne o współtransfekcji o różnych konfiguracjach w każdym dołku przy użyciu preferowanego odczynnika i zgodnie z opisem producenta.
- Do każdej studzienki dodać 125 ng każdego plazmidu ekspresyjnego do 50 μl zredukowanego podłoża bez surowicy w probówce o pojemności 0,6 ml i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Dodać 1 μl odczynnika do transfekcji w dół środka probówki i bezpośrednio do podłoża. Delikatnie zamieszać do wymieszania i pozostawić reakcję na 30 minut.
- Zmniejsz zawartość pożywki w każdym dołku szkiełka komory o około połowę. Dodaj mieszaninę transfekcji kroplami do studzienek i delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24–48 godzin. Zmień pożywkę następnego dnia po transfekcji.
- Obrazowanie komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym jak w Protokole 2, począwszy od kroku 2.1.4.
nuta: Próbka może być zobrazowana na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym, jeśli poziomy ekspresji są wysokie, a kamera jest wystarczająco czuła dla stosunkowo niskiej emisji fotonów PAmCherry1. Odtworzone cząsteczki PAmCherry1 mogą być aktywowane za pomocą zestawu filtrów ultrafioletowych (405 nm) przed obrazowaniem za pomocą zestawu filtrów o zielonym wzbudzeniu (561 nm).
- W stosownych przypadkach należy stworzyć kontrolę ujemną, na przykład poprzez wprowadzenie mutacji punktowej do jednego z białek będących przedmiotem zainteresowania, które zakłócają interakcję. Przeprowadź mutagenezę ukierunkowaną na plazmid klonujący białko, które ma być zmutowane i o wybranej konfiguracji.
- Wygeneruj stabilną linię komórkową, pakując konstrukty w cząsteczki wirusa i infekując komórki U2OS (lub linię komórkową z wyboru). Należy rozważyć indukowalny (tetracyklinowy) system ekspresji, aby można było indukować ekspresję przed obrazowaniem, jeśli problemem jest przedłużająca się nieodwracalność BiFC lub jeśli pożądana jest przestrajalna ekspresja.
ostrożność: Praca z wirusami jest klasyfikowana jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 2. Chociaż ostatnie generacje systemów pakowania wirusów znacznie zmniejszyły prawdopodobieństwo wytworzenia wirusów zdolnych do replikacji, pewne zagrożenia są nadal obecne. Piśmiennictwo można znaleźć na stronie http://www.cdc.gov/ bezpieczeństwo biologiczne /publikacje/.
- Powtórz krok 1.2.10, używając docelowego wektora soczewicy lub retrowirusa. Zwiększ kulturę O/N do 100 ml w celu uzyskania midiprepu i większej czystości plazmidów.
- W dniu 1: Umieść około 2 x 106 komórek 293T/17 w 10-centymetrowym naczyniu dla każdej konstruktu, która ma być zapakowana.
- Dzień 2: Przygotować reakcję transfekcji przy użyciu wybranego odczynnika do transfekcji, zgodnie z opisem producenta.
- Przygotować premiks plazmidów do pakowania o końcowych stężeniach 250 ng/μl do pakowania plazmidów 1 i 2 oraz 100 ng/μl do pakowania plazmidu 3 w sterylnej wodzie. Dodać 10 μl premiksu plazmidu do pakowania i 2,5 μg plazmidu docelowego do 1 ml zredukowanej pożywki bez surowicy w 5 ml probówce okrągłodennej z polipropylenu i pipetować w górę iw dół w celu wymieszania. Dodać 20 μl odczynnika do transfekcji w dół środka probówki i bezpośrednio do podłoża.
- Delikatnie mieszać do mieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Usunąć około połowy pożywki z komórek i dodać mieszaninę transfekcji kroplami. Wstrząsnąć delikatnie do wymieszania i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . Inkubować 10 ml pożywki na płytkę w probówce z poluzowaną nakrętką w celu uzyskania temperatury i wyrównania CO2 .
- W dniu 3: Delikatnie zmień pożywkę na wstępnie inkubowaną pożywkę i włóż komórki z powrotem do inkubatora. Inkubować kolejną probówkę z pożywką z poluzowaną nasadką. Uwaga: Syncytia, czyli tworzenie się dużych komórek wielojądrowych, może być znakiem, że opakowanie idzie dobrze. Jednak komórki są w stanie kruchym i można je łatwo odłączyć. Podczas wymiany pożywki należy przechylić pipetor tak, aby znajdował się w pozycji poziomej i dodawać pożywkę kroplami do jednej krawędzi płytki.
- Dzień 4: Zbierz wirusa, usuwając pożywkę za pomocą strzykawki i filtrując przez filtr o wielkości porów 0,45 μm do czystej probówki o pojemności 50 ml. Delikatnie zastąp pożywkę wstępnie inkubowaną pożywką.
- W dniu 5: Zebrać ponownie, jak to zrobiono wcześniej w kroku 1.5.3.3 i połączyć zwykły filtrat w tej samej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 6 ml koncentratora wirusów do każdej probówki i wymieszać. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny, aż wirus się wytrąci.
nuta: W zależności od stanu zdrowia komórek, wirus może zostać zebrany po raz trzeci.
- Zagęścić wirusa przez odwirowanie w temperaturze 1 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 μl pożywki. Wirusy mogą być natychmiast wykorzystane do zakażenia lub przechowywane w podwielokrotnościach 50 μl w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku.
- Umieść około 3 x 105 komórek U2OS (lub docelowych) na studzience na płytce 6-dołkowej (2 ml DMEM z 10% FBS na studzienkę) w celu infekcji, tak aby komórki były w około 50% zlewające się w momencie infekcji.
- Następnego dnia usuń około połowy podłoża, tak aby pozostało około 1 ml. Współinfekować 50 μl skoncentrowanego wirusa dla każdego konstruktu. Dodać 1 μl polibrenu (8 mg/ml) do każdego dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmień pożywkę następnego dnia i inkubuj jeszcze jeden dzień przed wyborem antybiotyku.
nuta: Ilość wirusa, który należy dodać, może się różnić w zależności od pożądanego wskaźnika infekcji. Wirusy można miareczkować za pomocą qRT-PCR.
- Dodaj antybiotyki, aby wybrać zakażone komórki. Oddzielne studzienki z niezainfekowanymi komórkami, które nie widziały wirusa, są wymagane jako kanarki w celu przetestowania skuteczności selekcji. Inkubować przez 2-7 dni lub do zakończenia selekcji.
nuta: Skuteczne stężenia powinny być początkowo miareczkowane, ale zazwyczaj wynoszą one 1,0 μg/ml dla puromycyny i 1,0 mg/ml dla neomycyny.
- Rozwiń komórki do większego 10-centymetrowego naczynia i przejdź do Protokołu 2.
2. Obrazowanie stałych komórek
- Przygotowanie próbki do obrazowania
- Wyczyść 8-dołkowe szkiełko komorowe #1.5 ze szklanym dnem, dodając 250 μl 1 M NaOH przez co najmniej 1 godzinę i dokładnie umyj PBS.
nuta: Nieobrobione szkiełka komory zazwyczaj powodują wysoki sygnał tła. Dodatkowo ogniwa mogą być wrażliwe na resztki NaOH, a brak dokładnego oczyszczenia powierzchni szkła (nawet 10-krotne mycie) może utrudnić przyleganie komórek. W razie potrzeby po umyciu inkubować oczyszczone szkiełko komorowe z PBS O/N. W przypadku wrażliwych linii komórkowych pomocne może być posiewanie o większej gęstości (np. przy początkowej konfluencji 50%-60%).
- Płytka około 5,5 x 104 komórek o stabilnej ekspresji U2OS na studzienkę w 350 μl DMEM wolnego od czerwieni fenolowej z 10% FBS, aby komórki były zdrowe i nie zlewały się nadmiernie podczas obrazowania.
- Wykonaj niezbędne zabiegi do eksperymentu, takie jak dodanie tetracykliny w celu wywołania ekspresji białka.
- Napraw komórki bezpośrednio przed obrazowaniem.
- Przed utrwaleniem należy przygotować świeży roztwór paraformaldehydu (PFA) — 3,7% PFA w 1x PHEM z 0,1% aldehydem glutarowym (GA). W przypadku 10 ml roztworu PFA odważyć 0,37 g PFA i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 ml wody destylowanej i 30 μl 1 M NaOH i odwirować. Podgrzewać w temperaturze 70 °C i wirować co 1-2 minuty, aż PFA całkowicie się rozpuści.
- Przenieś rozpuszczony PFA do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 3,8 ml wody destylowanej, 5 ml 2x buforu PHEM, 20 μl 25% aldehydu glutarowego i wiruj do wymieszania. Zapasowy, 2x bufor PHEM to 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA i 16 mM MgSO4, o pH dostosowanym do 7,0 przy 10 M KOH. Roztwór utrwalający może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka dni.
ostrożność: Zarówno PFA, jak i GA są niebezpieczne. Przygotuj roztwór w dygestoriach i noś odpowiedni sprzęt ochronny podczas obchodzenia się z obiema substancjami chemicznymi. Unikać wdychania lub bezpośredniego kontaktu ze skórą.
- Usuń podłoże wzrostowe. Szybko przemyć 500 μl PBS i dodać 250 μl utrwalacza PFA do dołka. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć utrwalacz PFA z próbki i dodać 350 μl PBS lub buforu do obrazowania (100 mM Tris z 30 mM NaCl i 20 mM MgCl2, pH 8,5) do dołka.
- Wiruj cząsteczki złota o długości 100 nm, aby rozbić agregaty i dodaj 35 μl na studzienkę (10x końcowe rozcieńczenie) w celu śledzenia dryfu etapu podczas obrazowania.
- Uzyskiwanie obrazów
- Włącz mikroskop. Włącz lasery 405 i 561 nm, ale w tym momencie nie zamykaj żaluzji (wewnętrznych lub zewnętrznych). Włącz kamerę EMCCD i pozwól jej ostygnąć. Upewnij się, że filtry 561 nm są na swoim miejscu.
- Otwórz oprogramowanie do akwizycji i ustaw czas ekspozycji na 100 ms, a wzmocnienie EMCCD na 300 (zakres 1 – 1,000).
- Dodaj olejek immersyjny do obiektywu i przymocuj próbkę do stolika mikroskopowego.
- Przy włączonym jasnym polu lub laserze 561 nm (~1 kW/cm2 ) ustawić ostrość próbki.
- Do obrazowania Ras i innych białek błonowych należy użyć apochromatycznego obiektywu TIRF 60X z aperturą numeryczną 1,49 i ustawić mikroskop w konfiguracji TIRF. Wyreguluj laser wzbudzający tak, aby był wyśrodkowany po uderzeniu w tylną aperturę obiektywu TIRF; Powoduje to odchylenie lasera po dotarciu do próbki. Kontynuuj regulację lasera, aż zostanie osiągnięty krytyczny kąt, a laser zostanie odbity z powrotem. Wyszukaj komórkę do zobrazowania z kilkoma cząsteczkami złota w polu widzenia. Ustaw obszar zainteresowania, który otacza komórkę (lub obszar w komórce) i cząsteczki złota.
Uwaga: TIRF zmniejsza głębokość penetracji lasera wzbudzającego i redukuje nieostry sygnał tła. Ponadto korekta dryfu będzie prawdopodobnie dokładniejsza, gdy w polu widzenia jest więcej cząstek złota.
- Jeśli to możliwe, włącz system autofokusa, aby skorygować dryft próbki w kierunku z. W przeciwnym razie należy ręcznie wyregulować ostrość podczas akwizycji, jeśli obraz jest nieostry.
- Rozpocznij akwizycję przy wyłączonym laserze 405 nm i włączonym laserze 561 nm (~1 kW/cm2) w przypadku, gdy następuje już wystarczająca aktywacja (zwykle jeśli poziomy ekspresji są wysokie). W przeciwnym razie włącz laser 405 nm przy najniższym fabrycznym ustawieniu mocy (0,02 mW lub 0,01 W/cm2) i stopniowo zwiększaj (0,1 mW na raz) w razie potrzeby, aż w jednej klatce będzie kilkadziesiąt cząsteczek lub tak, aby pojedyncze cząsteczki były dobrze oddzielone.
- W miarę kontynuowania akwizycji danych stopniowo zwiększaj moc lasera 405 nm, aby utrzymać gęstość plamki na mniej więcej stałym poziomie. Uwaga: Przy niższej mocy wzbudzenia 405 nm niektóre PAmCherry1 mogą być już aktywowane. W miarę jak te cząsteczki fotowybielają, populacja pozostałych fotoaktywowanych cząsteczek PAmCherry1 zmniejsza się, co wymaga większego strumienia fotonów, aby utrzymać tę samą gęstość cząsteczek emitujących fluorescencję w każdej klatce.
- Kontynuuj akwizycję obrazu, aż wysoka moc 405 nm (2,5 – 10 W/cm2) nie aktywuje więcej zdarzeń aktywacji.
nuta: Całkowity czas akwizycji zależy od poziomu ekspresji i skuteczności uzupełnienia.
Tabela 1. Startery do linearyzacji klonowania plazmidów zawierających fragmenty PAmCherry1. Klonujące plazmidy zawierające RN i RC można zlinearyzować za pomocą odwrotnej reakcji PCR w punkcie insercji na końcu N lub C fragmentów. Sekwencje są wymienione od 5' do 3'.
powiedział:
| Sekwencja podkładowa (od 5' do 3') |
| Klonowanie plazmidu w celu insercji na odwróconym końcu N | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC powiedział: |
| RN na N-końcu do przodu | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA powiedział: |
| RC na N-końcu do przodu | GGCGCCCTGAAGGGCGA powiedział: |
| Klonowanie plazmidu w celu insercji na C-końcu do przodu | TAAAAGGGTGGGCGCCC |
| RN od C-końca odwrotnego | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC powiedział: |
| RC od C-końca wstecznego | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG powiedział: |
Tabela 2. Zwisy dla starterów genu będących przedmiotem zainteresowania, które pasują do starterów z tabeli 1.
15 par zasad homologii dla reakcji niezależnej od ligacji jest generowanych z nawisów starterów. Dodatkowo zwisy zawierają sekwencję dla elastycznego łącznika (GGGGS)x2. Zamiast tego można dodać elastyczną sekwencję łącznika do starterów w tabeli 1. Sekwencje są wymienione od 5' do 3'.
:
| Zwisy dla genu starterów będących przedmiotem zainteresowania (5' do 3') |
| Wstawianie N-zacisku RN lub RC do przodu | GAGCTCGGTACCATG powiedział: |
| Wstawianie końcówki N RN rewers | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| Wstawianie N-zacisku RC rewers | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC powiedział |
| Wstawienie końcówki C RN do przodu | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| Wkładanie zacisku C RC do przodu | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| Wstawianie końcówki C RN lub odwrócony RC | GCGCCCACCCTTTTA powiedział: |