$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Znakowanie SBDS-FlAsH barwnikiem fluorescencyjnym FlAsH 4',5'-Bis(1,3,2 ditioarsolan-2-yl) Fluoresceina
- Zmieszać 3 nmol białka SBDS-FlAsH (znacznik FlAsH odpowiada motywowi tetracysteiny Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys genetycznie zmodyfikowanemu na C-końcu rekombinowanego białka SBDS) z 3 nmol barwnika fluoresceinowego 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-ylo) w 5 μl objętości buforu anizotropowego (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerol, 5 mM β-merkaptoetanolu).
- Pozostawić reakcję do 8 godzin w temperaturze 4 °C. Badać próbkę w stosunku do buforu anizotropowego przez noc w celu usunięcia wolnego barwnika.
- Użyj prawa Lamberta-Beera, aby określić ilościowo % znakowanego białka. Zmierzyć absorbancję przy 280 nm i 508 nm w spektrofotometrze przy użyciu kuwety kwarcowej o odpowiedniej objętości. nuta: Rozważ następujące molowe współczynniki absorpcji (M-1 cm-1):
Równanie 1
- Obliczyć stężenie znakowanego białka SBDS-FlAsH za pomocą równania 2.
Równanie 2
- Obliczyć stężenie całkowitego białka SBDS, korzystając z równania 3, podstawiając obliczoną wartość CSBDS-FlAsH z poprzedniego kroku.
Równanie 3
- Obliczyć procentową zawartość znakowanego białka za pomocą równania 4.
Równanie 4
2. Eksperymenty z anizotropią fluorescencyjną
UWAGA: Eksperymenty anizotropowe zostały przeprowadzone w spektrofluorometrze wyposażonym w zestaw narzędzi do polaryzacji, a zbieranie danych przeprowadzono za pomocą programu do anizotropii dostarczonego w oprogramowaniu urządzenia. Długość fali wzbudzenia ustalono na 494 nm przy szerokości pasma widmowego 8 nm, a emisję zarejestrowano za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 530±25 nm. Pomiary wykonano w temperaturze 25 °C w kuwecie o pojemności 200 μl i długości ścieżki 5 mm.
- W kuwecie fluorescencyjnej umieścić 200 μl 30 nM SBDS-FlAsH w buforze anizotropii i miareczkować 2 μl 30 μM EFL1. Dokładnie wymieszaj i odstaw reakcję na 3 minuty przed pomiarem wartości anizotropii.
- Powtarzać krok 2.1 aż do dodania całkowitej objętości 40 μl EFL1.
3. Analiza danych
- Dopasuj dane do odpowiedniego modelu powiązania przy użyciu nieliniowego algorytmu regresji metodą najmniejszych kwadratów. Równania dla najczęściej spotykanych modeli powiązań przedstawiono w tabeli 1.
- Oceń najlepszy model, który opisuje interakcję między białkami, sprawdzając pozostałości dopasowania. Wesprzyj wybrany model dodatkowymi eksperymentami.
Tabela 1. Typowe modele powiązań białko-białko i równania matematyczne, które je opisują.
