Wykrywanie interakcji białko-białko oparte na anizotropii fluorescencyjnej

1. Znakowanie SBDS-FlAsH barwnikiem fluorescencyjnym FlAsH 4',5'-Bis(1,3,2 ditioarsolan-2-yl) Fluoresceina

1. Zmieszać 3 nmol białka SBDS-FlAsH (znacznik FlAsH odpowiada motywowi tetracysteiny Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys genetycznie zmodyfikowanemu na C-końcu rekombinowanego białka SBDS) z 3 nmol barwnika fluoresceinowego 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-ylo) w 5 μl objętości buforu anizotropowego (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 10% glicerol, 5 mM β-merkaptoetanolu).
2. Pozostawić reakcję do 8 godzin w temperaturze 4 °C. Badać próbkę w stosunku do buforu anizotropowego przez noc w celu usunięcia wolnego barwnika.
3. Użyj prawa Lamberta-Beera, aby określić ilościowo % znakowanego białka. Zmierzyć absorbancję przy 280 nm i 508 nm w spektrofotometrze przy użyciu kuwety kwarcowej o odpowiedniej objętości. nuta: Rozważ następujące molowe współczynniki absorpcji (^{M-1 cm-1}):
   Równanie 1
4. Obliczyć stężenie znakowanego białka SBDS-FlAsH za pomocą równania 2.
   Równanie 2
5. Obliczyć stężenie całkowitego białka SBDS, korzystając z równania 3, podstawiając obliczoną wartość C_SBDS-FlAsH z poprzedniego kroku.
   Równanie 3
6. Obliczyć procentową zawartość znakowanego białka za pomocą równania 4.
   Równanie 4

2. Eksperymenty z anizotropią fluorescencyjną

UWAGA: Eksperymenty anizotropowe zostały przeprowadzone w spektrofluorometrze wyposażonym w zestaw narzędzi do polaryzacji, a zbieranie danych przeprowadzono za pomocą programu do anizotropii dostarczonego w oprogramowaniu urządzenia. Długość fali wzbudzenia ustalono na 494 nm przy szerokości pasma widmowego 8 nm, a emisję zarejestrowano za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 530±25 nm. Pomiary wykonano w temperaturze 25 °C w kuwecie o pojemności 200 μl i długości ścieżki 5 mm.

1. W kuwecie fluorescencyjnej umieścić 200 μl 30 nM SBDS-FlAsH w buforze anizotropii i miareczkować 2 μl 30 μM EFL1. Dokładnie wymieszaj i odstaw reakcję na 3 minuty przed pomiarem wartości anizotropii.
2. Powtarzać krok 2.1 aż do dodania całkowitej objętości 40 μl EFL1.

3. Analiza danych

1. Dopasuj dane do odpowiedniego modelu powiązania przy użyciu nieliniowego algorytmu regresji metodą najmniejszych kwadratów. Równania dla najczęściej spotykanych modeli powiązań przedstawiono w tabeli 1.
2. Oceń najlepszy model, który opisuje interakcję między białkami, sprawdzając pozostałości dopasowania. Wesprzyj wybrany model dodatkowymi eksperymentami.

Tabela 1. Typowe modele powiązań białko-białko i równania matematyczne, które je opisują.