Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania kompleksów czynnik transkrypcyjny-DNA

Streszczenie

Źródło: Hsieh, Y. W. et al., Zoptymalizowany protokół testu przesunięcia mobilności elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni. J. Vis. Exp. (2016)

W tym filmie demonstrujemy test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania interakcji białko-DNA za pomocą sond DNA znakowanych fluorescencyjnie w podczerwieni. Kiedy białko wiąże się z sondą DNA, tworzy duży kompleks, który migruje powoli i pojawia się jako przesunięta prążek na żelu.

Protokół

1. Reakcja wiązania i elektroforeza

1. Przygotować 1 ml 5x buforu wiążącego, mieszając 50 μL 1 M Tris-HCl o pH 7,5; 10 μL 5 M NaCl; 200 μL 1 M KCl, 5 μL 1 M MgCl₂, 10 μL 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 μL 1 M DTT; 25 μL 10 mg/ml BSA, i 695 μL ddH₂O.
   nuta: 5x bufor wiążący może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C. Inną kwestią do rozważenia jest to, że różne czynniki transkrypcyjne będą miały różne modyfikacje bufora wiążącego.
2. Tuż przed rozpoczęciem reakcji wiązania należy wstępnie uruchomić 5% natywny żel poliakryloamidowy w 0,5x TBE + 2,5% glicerolu, aby usunąć wszelkie ślady nadsiarczanu amonu przy napięciu 80 V przez 30 - 60 minut lub do momentu, gdy prąd przestanie się zmieniać w czasie.
3. Ustawić reakcję wiązania w końcowej objętości 20 μl.
   1. Wymieszaj 4 μl 5x buforu wiążącego, 80 - 200 ng oczyszczonego białka A (w 50% glicerolu, tj. SOX-2), 1 μL 0,1 μM sondy sprzężonej z barwnikiem (końcowe stężenie: 5 nM) i ddH₂O.
   2. Opcjonalnie: Gdy wymagana jest zimna sonda, dodaj różne stężenia (2x, 10x, 25x, 50x, 100x itd.) zimnych sond.
   3. Opcjonalnie: Podczas badania interakcji między białkami A i B (tj. SOX-2 i LIM-4) dodać 80 - 200 ng oczyszczonego białka B (w 50% glicerolu, tj. LIM-4).
   4. Opcjonalnie: W przypadku stosowania preparatu ekstraktu jądrowego i walidacji specyficznego wiązania białka A należy dodać przeciwciało specyficzne dla białka A (tj. anty-6xHis, anty-FLAG itp.).
   5. Inkubować w R/T w ciemności przez 15 minut.
4. Załaduj wszystkie reakcje wiązania na żel i uruchom żel pod napięciem 10 V/cm na żądaną odległość.

2. Obrazowanie

UWAGA: Żel został zeskanowany bezpośrednio w szklanych płytkach za pomocą zaawansowanego systemu obrazowania w podczerwieni. W związku z tym żel może być dalej rozpuszczany i wielokrotnie skanowany (ryc. 1C i 2). System obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni, głównie dla Western blot, został również przetestowany w celu zeskanowania żelu, ale tylko zaawansowany system obrazowania w podczerwieni był w stanie zeskanować żel z dobrą rozdzielczością. Opisana metodologia jest specyficzna dla konkretnego oprogramowania do obrazowania w podczerwieni, chociaż mogą być używane inne pakiety oprogramowania.

1. Wyczyść łóżko skanera za pomocą ddH₂O i dobrze wysusz przed skanowaniem. Wytrzyj do sucha szklane płytki żelu i umieść płytki zawierające żel na łóżku skanera.
2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania w podczerwieni i przejdź do zakładki "Pobierz". Po umieszczeniu cieńszej płytki (1 mm) na stole skanera użyj ustawień Kanał: 700, Intensywność: Auto, Rozdzielczość: 169 μm, Jakość: średnia i Przesunięcie ostrości: 1,5 mm. Po umieszczeniu grubszej płytki (3 mm) na stole skanera należy użyć ustawień Kanał: 700, Intensywność: Auto, Rozdzielczość: 84 μm, Jakość: średnia i Przesunięcie ostrości: 3,5 mm. Przesunięcie ostrości zależy od grubości płyty szklanej.
3. Wybierz obszar, który żel zajmuje na skanerze. Kliknij "Start", aby rozpocząć skanowanie.

Wyniki

Rysunek 1. fEMSA przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni. (A) Schemat blokowy fEMSA. (B) Wpływ barwnika błękitu bromofenolowego, pomarańczy G i dI-dC (1 μg) na fEMSA. Zastosowano 5 nM sondy 5'Dye-LIM-4/SOX-2. (C)fEMSA wykazująca swoistość wiązania 6xHis-SOX-2^G73E z miejscem docelowym SOX-2 elementu LIM-4/SOX-2. Zastosowano 5 nM ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
30% roztwór akryloamidu/bis, 37,5:1	Bio-Rad	1610158	Akrylamid jest szkodliwy i toksyczny.
Surowica bydlęca Albumina klasy biologii molekularnej	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał B9000S
Oligonukleotydy DNA znakowane 5'IRDye700	Zintegrowane technologie DNA	Niestandardowy oligo DNA	W manuskrypcie są one określane jako oligonukleotydy DNA znakowane barwnikiem 5'Dye lub fluorescencyjnym barwnikiem w podczerwieni. Firma będzie syntetyzować na zamówienie oligonukleotydy DNA znakowane 5' IRDye. Wymaga syntezy w skali co najmniej 100 μM i oczyszczania HPLC.
Pionowa komórka elektroforetyczna Mini-PROTEAN	Bio-Rad	1658000FC	urządzenie
System obrazowania w podczerwieni Odyssey CLx	LI-COR Biotechnologia	System obrazowania w podczerwieni Odyssey CLx	urządzenie
System obrazowania Odyssey Fc	LI-COR Biotechnologia	System obrazowania Odyssey Fc w dwóch trybach	urządzenie
Oprogramowanie Image Studio (wersja 4.0)	LI-COR Biotechnologia	Oprogramowanie Image Studio	oprogramowanie
Pomarańczowy G	Sigma-Aldrich	O3756-25G	chemiczny
6x pomarańczowy barwnik ładujący			0,25% pomarańczy g; 30% glicerolu
0,5x TBE			45 mM tris-boranu; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
5x Bufor Wiązania			50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM naziemna telewizja cyfrowa; 250 ug/ml BSA