Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Oczyszczanie komórek linii oligodendrocytów PDGFRα dodatnich z mózgu myszy (zmodyfikowane w stosunku do wcześniej opisanych protokołów immunopanningu)
- Przygotowanie płytki immunologicznej do PDGFRα dodatniej selekcji komórek i 2 płytek do zubożenia komórek śródbłonka i mikrogleju.
nuta: Należy pamiętać, że szalki Petriego, ale nie szalki z kulturami komórkowymi, sprawdzają się w eksperymencie immunopanningowym; Jeżeli oczyszczone komórki będą używane do hodowli, etapy immunopanowania muszą być przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego
- Pokryć 10-centymetrową płytkę Petriego 30 μl koziej anty-szczurzej IgG w 10 ml pH 9,5, 50 mM Tris-HCl przez noc w temperaturze 4 °C. Wstrząsnąć płytką, aby upewnić się, że powierzchnie płytek są równomiernie i całkowicie pokryte roztworem powlekającym.
- Przygotować roztwór przeciwciała PDGFRα, rozcieńczając 40 μl szczurzego przeciwciała anty-PDGFRα z 12 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco zawierającego 0,2% BSA.
- Po 3 przemyciach płytki pokrytej IgG z 10 ml 1x DPBS każde, inkubować płytkę pokrytą IgG z roztworem przeciwciała PDGFRα w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
- Umyć płytkę pokrytą przeciwciałem anty-PDGFRα szczura 3 razy po 10 ml 1x DPBS każda. Delikatnie dodaj roztwór DPBS wzdłuż bocznej ścianki płytki i nie naruszaj powlekanych powierzchni.
- Pokryj 2 nowe 15 cm płytki Petriego do zubożenia komórek śródbłonka i mikrogleju 20 ml DPBS zawierającego 2,3 μg/ml lektyny Banderiaea simplicifolia 1 (BSL-1) przez 2 godziny.
- Umyj płytki powlekane BSL-1 3 razy 20 ml 1x DPBS. Delikatnie dodaj roztwór DPBS wzdłuż bocznej ścianki płytek i nie naruszaj powlekanych powierzchni.
- Oczyszczanie komórek linii oligodendrocytów PDGFRα dodatnich jest modyfikowane w stosunku do wcześniej opublikowanych metod.
- Wypreparuj tkanki korowe z 2 mózgów myszy w 7. dniu po urodzeniu (P7) zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami.
- Dysocjuj tkanki, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową za pomocą zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych (P) zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami producenta.
- Krótko mówiąc, pociąć wypreparowane tkanki korowe na kawałki za pomocą skalpela i poddać je trawieniu enzymatycznemu w temperaturze 37 °C. Po roztrawieniu ręcznie oddzielić kawałki za pomocą pipet Pasteura z polerowanego ogniowo szkła do zawiesiny jednokomórkowej.
- Odwirować zawiesinę jednokomórkową o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zawiesić osad komórkowy za pomocą 15 ml buforu do badania immunologicznego (bufor do płukania immunologicznego to DPBS z 0,02% BSA i 5 μg/ml insuliny).
- Zawiesinę jednokomórkową z 2 mózgów myszy inkubować sekwencyjnie na 2 płytkach pokrytych BSL-1 przez 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem płytki co 5 minut, aby zapewnić lepsze zubożenie komórek mikrogleju i śródbłonka.
- Delikatnie zamieszać płytkę, aby zebrać nieprzylegające komórki w zawiesinie komórkowej i inkubować je na płytce pokrytej przeciwciałem szczura-PDGFRα przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
- Po inkubacji zawiesiny komórkowej na płytce pokrytej przeciwciałem szczura-PDGFRα, delikatnie zakręć płytką, aby zebrać zawiesinę komórkową, i przepłucz płytkę 8 razy DPBS, aby pozbyć się komórek nieprzylegających. Delikatnie dodaj roztwór myjący wzdłuż bocznej ścianki płytki i kilkakrotnie porusz płytkę, aby pozbyć się nieprzylegających komórek.
- Odłączyć komórki od płytki pokrytej przeciwciałem szczura-PDGFRα za pomocą 4 ml roztworu do oddzielania komórek przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Wstrząsnąć płytką w celu usunięcia przylegających komórek.
- Zebrać oczyszczone OPC przez odwirowanie przy 300 x g w temperaturze pokojowej, zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml pożywki do hodowli komórek OPC i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru (500 ml pożywki do hodowli komórkowych w pożywce DMEM/F12 zawierającej 5 ml roztworu penicyliny i streptomycyny (P/S), 5 ml N2, 10 ml B27, 5 μg/ml insuliny, 0,1% BSA, 20 ng/ml bFGF i 10 ng/ml PDGFRα).
- Walidacja czystości OPC po immunopanningu.
- W celu oceny wzbogacenia OPC po immunopanningu, należy użyć niektórych oczyszczonych OPC do ekstrakcji RNA za pomocą ekstrakcji na bazie tiocyjanianu guanidu zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wykonaj qRT-PCR przy użyciu fluorescencyjnej mieszanki głównej z zielonym barwnikiem, aby sprawdzić wzbogacenie ekspresji PDGFRα w oczyszczonych OPC w porównaniu ze zdysocjowanymi komórkami mózgowymi zgodnie z wcześniej opublikowanymi materiałami.
- Dodatkowo należy zasiać niektóre oczyszczone OPC w 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną w celu barwienia immunologicznego przeciwciałem anty-NG2 proteoglikanem siarczanu chondroityny (NG2), zgodnie z wcześniej opublikowanymi materiałami.
2. Przygotowanie niskokomórkowego ChIP i budowa biblioteki ChIP dla sekwencjonowania o wysokiej przepustowości
- Olig2 Niskokomórkowy preparat ChIP z dostępnym na rynku systemem sonikacji i dostępnym w handlu zestawem ChIP o niskiej liczbie komórek (patrz Tabela materiałów), postępując zgodnie ze szczegółowymi standardowymi procedurami zawartymi w instrukcjach producenta.
- Po odłączeniu od szczura płytki pokrytej przeciwciałem anty-PDGFRα i zliczeniu komórek za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru umieścić 20 000 oczyszczonych OPC w 1 ml pożywki do hodowli komórek OPC dla każdej reakcji ChIP.
- Dodaj 27 μl 36,5% formaldehydu, aby utrwalić zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
ostrożność: Należy pamiętać, że ze względów bezpieczeństwa w dygestoriach chemicznych należy stosować formaldehyd.
- Zatrzymaj sieciowanie DNA-białko za pomocą 50 μl 2,5 M glicyny na 5 minut w temperaturze pokojowej.
nuta: Od tego momentu wszystkie czynności muszą być wykonywane na lodzie lub w chłodni o temperaturze 4 °C.
- Umyj usieciowane granulki komórkowe 1 ml lodowatego roztworu soli Hanksa (HBSS) z koktajlem inhibitorów proteazy i poddaj komórki granulowaniu za pomocą wstępnie schłodzonej wirówki o temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C.
- Lizuj osad komórkowy w 25 μl kompletnego buforu do lizy przez 5 minut na lodzie.
nuta: Wstrząsnąć probówką, aby zawiesić komórki w buforze do lizy.
- Uzupełnij lizat komórkowy 75 μl lodowatego HBSS zawierającego koktajl inhibitorów proteazy i ścinaj chromatynę lizatu komórkowego za pomocą wstępnie schłodzonego systemu sonikacji z 5 cyklami 30 s ON i 30 s OFF program. Zawsze poddawaj sonifikacji 6 probówek razem i upewnij się, że probówki równoważące zawierają 100 μl wody.
- Po ścinaniu odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a po odwirowaniu zebrać supernatant do nowej probówki.
- Rozcieńczyć 100 μl ściętej chromatyny równą objętością lodowatego kompletnego buforu ChIP z inhibitorem proteazy.
- Zaoszczędź 20 μl rozcieńczonej chromatyny ściętej jako wejściową próbkę kontrolną.
nuta: Wlotowa próbka kontrolna jest również wymagana jako porównanie z próbką immunoprecypitowaną Olig2 w celu identyfikacji DNA immunoprecypitowanego przeciwciała Olig2.
- Dodać 1 μl króliczego przeciwciała anty-olig2 do 180 μl rozcieńczonej ściętej chromatyny i inkubować probówkę reakcyjną na obracającym się kole z prędkością 40 obr./min przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
nuta: Wykonaj ten krok w zimnym pomieszczeniu.
- Dla każdej reakcji ChIP przemyj 11 μl kulek pokrytych białkiem magnetycznym A za pomocą 55 μl buforu do płukania kulek i umieść granulki w 11 μl buforu do płukania kulek po 2 praniach.
nuta: Wykonaj ten krok w zimnym pomieszczeniu.
- Do każdej reakcji ChIP dodać 10 μl wstępnie umytych kulek pokrytych białkiem A do probówki reakcyjnej ChIP. Wykonaj ten krok w zimnym pomieszczeniu.
- Inkubować probówkę reakcyjną ChIP w temperaturze 4 °C przez kolejne 2 godziny na obracającym się kole.
- Umieść probówkę reakcyjną ChIP na stojaku magnetycznym na 1 min.
nuta: Wykonaj ten krok w zimnym pomieszczeniu.
- Usuń supernatant i nie usuwaj granulki kulki.
- Przemyć granulkę kulki odpowiednio 100 μl dla każdego z 4 płuczących przez 4 minuty na obracającym się kole w temperaturze 4 °C.
- Po przepłukaniu dodać 200 μl buforu elucyjnego do osadu kulkowego i inkubować probówkę reakcyjną ChIP w temperaturze 65 °C przez 4 godziny w celu odwrócenia usieciowania białko-DNA.
- Dodatkowo dodać 180 μl buforu elucyjnego do 20 μl wejściowej próbki kontrolnej i inkubować w temperaturze 65 °C przez 4 godziny, aby również odwrócić wiązanie krzyżowe białka-DNA.
- Dodać 200 μl mieszaniny fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego 25:24:1 (v/v) do każdej probówki reakcyjnej ChIP.
- Wirować energicznie przez 1 minutę i wirować przy 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną fazę do nowej probówki.
- Dodać 40 μl 3 M roztworu octanu sodu, 1 000 μl 100% etanolu i 2 μl strącacza glikogenu kowalencyjnie połączonego z niebieskim barwnikiem do każdej probówki reakcyjnej ChIP przez noc w temperaturze -20 °C.
- Wirować przy 13 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić sklarowany osad, przemyć 500 μl zimnego 70% etanolu i odwirować przy 13 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Wyrzuć sklarowany szwadron, utrzymuj osad w suchym stanie przez 10 minut i rozpuść go w 50 μl wody.
- Budowa biblioteki ChIP do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości
- Oczyść i zagęść DNA ChIP za pomocą zestawu do czyszczenia zgodnie z instrukcjami producenta.
- Oznacz ilościowo próbkę ChIP za pomocą piko-zielonego zgodnie z instrukcjami producenta.
- Użyj zestawu ChIP-seq do T-tailingu, replikacji i tailingu, przełączania i rozszerzania szablonów, dodawania adapterów i wzmacniania, wyboru rozmiaru biblioteki i oczyszczania zgodnie z instrukcjami producenta.
- Po denaturacji dsDNA, defosforylować koniec 3' ssDNA za pomocą fosfatazy alkalicznej krewetek i dodać ogon poli (T) do ssDNA za pomocą końcowej transferazy deoksynukleotydylu.
- Wyżarzać starter DNA Poly (dA) do matrycy ssDNA w celu replikacji DNA i przełączania matrycy.
- Po przełączeniu szablonu wzmocnij bibliotekę ChIP-seq metodą PCR ze starterami do przodu i do tyłu do indeksowania.
- Wybierz bibliotekę ChIP-seq amplifikowaną do PCR z fragmentami w zakresie od 250 do 500 pz za pomocą kulek paramagnetycznych za pomocą opcji 2 dla wyboru podwójnego rozmiaru.
- Zbadaj jakość wybranej biblioteki ChIP-seq za pomocą mikroprzepływowego urządzenia do elektroforezy chipowo-kapilarnej.