1. Mikroskopia polaryzacyjna
- W przypadku szerokokątnego oświetlenia laserowego należy skupić linię 638 nm ciągłego lasera diodowego (40 mW) na aperturze światłowodu wielomodowego w celu oczyszczenia wiązki. Zamontuj polaryzator liniowy na wyjściu światłowodu, aby ustawić polaryzację światła laserowego.
- Zablokuj składową wzbudzenia emitowanego światła za pomocą lustra dichroicznego (odcięcie 640 nm) i filtra pasmowoprzepustowego (pasmowoprzepustowe 700/75).
- Niech sygnał fluorescencji przejdzie przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej, który rozdziela emitowane światło na jego prostopadłe i równoległe spolaryzowane składowe. Następnie należy skupić wiązkę nieodbitą (składowa równoległa) i wiązkę odbitą (składową prostopadłą) za pomocą obiektywu achromatycznego o ogniskowej 200 mm na chipie kamery EM-CCD w świetle wstecznym (rys. 1b i 1c). Użyj lustra, aby wyregulować kierunek wiązki prostopadłej w kierunku soczewki.
2. Projektowanie i testowanie referencyjnego oligomeru DNA znakowanego fluorescencyjnie
- Określ sekwencję rdzenia referencyjnego DNA: metoda opiera się na teście konkurencyjnym, który mierzy stałą dysocjacji (KD2) między czynnikiem transkrypcyjnym a nieznakowanym oligomerem konkurencyjnego DNA, który konkuruje o wiązanie z fluorescencyjnie znakowanym DNA, którego powinowactwo do TF działa jako odniesienie (KD1). Sekwencja konsensusu uzyskana z innych źródeł, takich jak ślad DNazy lub bakteryjna hybryda 1, może służyć jako punkt wyjścia.
nuta: Z reguły odpowiednie referencyjne DNA ma od 3 do 7-krotnie mniejsze powinowactwo wiązania do TF w porównaniu z sekwencją konsensusu.
- Zmierz za pomocą HiP-FA KD1s 2-3 wstępnych pojedynczych mutacji sekwencji konsensusu uzyskanej w poprzednim kroku. Spróbuj zmutować pozycje w sekwencjach konsensusu, które nie są zbyt szczegółowe, aby uniknąć całkowitej utraty wiązania.
nuta: Ważne jest, aby sekwencja referencyjna była związana przez interesujący nas czynnik transkrypcyjny (użyliśmy w tym protokole Giant Gt), ale nie za mocno, aby słabsi konkurenci mogli ją wyprzedzić przy wysokich stężeniach.
- Rozciągnij motyw rdzenia (zazwyczaj 8-12 par podstaw) do długości 16 par zasad lub więcej, dodając symetrycznie flankującą sekwencję po obu stronach (dodaj boczne łańcuchy, aby zapewnić prawidłowe wiązanie). W razie potrzeby (na przykład w przypadku dłuższych domen wiążących) użyj dłuższych sekwencji (za pomocą testu HiP-FA przetestowano do ~50 par zasad za pomocą testu HiP-FA).
ostrożność: Uważaj, aby nie dodawać zasad, które mają tworzyć ektopowe miejsca wiązania. Użyj narzędzi obliczeniowych, które przewidują miejsca wiązania z dostępnych PWM, aby ułatwić ten proces (np. PySite).
- Jako znakowane referencyjne DNA, uporządkuj oligomery, które są znakowane fluorescencyjnie na przedniej lub odwrotnej nici na końcu 3' lub 5'. Użyć, na przykładample, Cy5, Bodipy-650 lub innego odpowiedniego barwnika o stężeniu 10 μM (100 μM 10x zapas) w wodzie i rozcieńczać stopniowo, jak opisano w kroku 3.1.
- Przygotuj 500 ml 1x buforu wiążącego, dodając 33 mM buforu fosforanu potasu (pH = 7,0), 90 mM NaCl i 0,01% niejonowego detergentu w wodzie destylowanej. Przygotuj również 3x bufor wiążący, który zawiera te same składniki, z wyjątkiem trzykrotnych stężeń. W przypadku użycia buforu wiążącego 3x jako roztworu podstawowego dla buforu wiążącego 1x, należy przygotować objętość > 500 ml; w przeciwnym razie przygotuj 250 ml.
nuta: Kompozycja ta została zoptymalizowana pod kątem stabilności czynnika transkrypcyjnego i zapobiegania dimeryzacji S-transferazy glutationowej (GST).
- Zmierz za pomocą zestawu mikroskopowego opisanego w kroku 1 FA 200 μl buforu wiążącego zawierającego 0,8 nM znakowanego referencyjnego DNA w obecności różnych ilości TF w 96-dołkowej płytce mikroskopii ze szklanym dnem (5-6 dołków o różnych stężeniach TF) w celu określenia stężenia TF do użycia. Wykonać serię miareczkowania z rosnącą ilością TF i wybrać do testu stężenie, dla którego krzywa osiąga plateau, wskazując na całkowite związanie referencyjnego oligomeru DNA.
nuta: Optymalne stężenie TF zależy od wartości stałych dysocjacji TF-DNA. Ogólnie rzecz biorąc, niższeK Ds wymagają niższych stężeń.
3. Wyżarzanie oligomerów
- Aby wyżarzyć oligomery DNA znakowanego referencyjnego DNA (sekwencja określona w poprzednim kroku), należy zmieszać 7 μl 10 mM znakowanego barwnikiem roztworu jednoniciowego DNA i 7 μl 10 mM stężenia jego nieznakowanego odwrotnego dopełniacza w 186 μl wody.
- W przypadku konkurencyjnych sekwencji DNA zmieszać 20 μl 100 mM roztworów (w wodzie, dostarczonej przez producenta) jednoniciowego DNA z przodu z 20 μl 100 mM odpowiedniego odwrotnego jednoniciowego DNA dla każdej indywidualnej sekwencji konkurenta, która ma być zmierzona.
- Wyżarzanie należy przeprowadzić oddzielnie w standardowym cyklerze PCR, podgrzewając roztwory do 70 °C przez 3 minuty i obniżając temperaturę do RT z szybkością 0,1 K/s. Jeśli używana maszyna do PCR nie obsługuje gradientów temperatury w tym tempie, po prostu wykonuj stopniowe inkubacje ze spadającymi temperaturami (testowano 99 cykli po 3 s z -0,4 K na cykl).
4. Przygotowanie żelu
UWAGA: Poniższa sekcja wyjaśnia przygotowanie dwóch różnych rodzajów żeli: 1) studzienki miareczkowe zawierają żele z białkiem i są używane do określania KDs dla odpowiednich konkurencyjnych sekwencji DNA, oraz 2) studnie kalibracyjne wykorzystują NB do określania stężenia DNA w każdym danym punkcie czasowym i wysokości akwizycji. Nacisk kładziony jest na przygotowanie eksperymentu na płytce 96-dołkowej, ale wskazane są również odpowiednie objętości dla formatu płytki 384-dołkowej.
- Rozpuścić 0,5% w/v agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze wiążącym, gotując ją w laboratoryjnej kuchence mikrofalowej. Po całkowitym rozpuszczeniu ponownie wyreguluj objętość za pomocą ddH2O, aby skompensować możliwe parowanie.
nuta: Dla wygody przygotuj zapas 10-20 10 ml porcji żeli i rozpuść je w temperaturze 75°C, gdy będą potrzebne. Zapasy żelowe można przechowywać w RT.
ostrożność: Uważaj, aby nie przegrzać roztworu żelu w kuchence mikrofalowej. Preferowane są krótkie odstępy czasu nagrzewania z wytrząsaniem pomiędzy nimi.
- Aby przygotować studzienki do miareczkowania i kalibracji, należy najpierw stopić dwie podwielokrotności żelu o pojemności 10 ml w temperaturze 75 °C pod wpływem wstrząsu.
- Użyj 240 μl (w tym 20% narzutu) dla każdego zawodnika (n = liczba sekwencji zawodników).
- Użyj tej samej objętości żelu do kalibracji NB, aby zapewnić równą temperaturę i lepkość obu żeli.
- Następnie ustaw temperaturę na 35 °C i poczekaj, aż temperatura się zrównoważy.
- Do studzienek miareczkowych dodać 1,4 nM (stężenie końcowe) zhybrydyzowanego referencyjnego DNA (otrzymanego w etapie 3), białka TF (stężenie końcowe CTF = 20-60 nM, jak określono w kroku 2.6), DTT (0,2 mM) i buforu wiążącego w całkowitej objętości n x 200 μL lub n x 13 μL w formie płytki 96- lub 384-dołkowej, odpowiednio (plus narzut). Dokładnie wymieszaj, odwracając/wstrząsając (nie wirować).
- Powoli dodawać 200 μl na studzienkę w formacie płytki 96-dołkowej (13 μl/studzienkę na 386 dołków) roztworu żelu przygotowanego w poprzednim kroku do studzienek miareczkowych płytki studzienki.
- W przypadku dołków kalibracyjnych, najpierw dodaj 5 nM NB do stopionego żelu na zewnątrz studzienek (całkowita objętość zależy od użytego formatu płytki dołkowej i liczby dołków kalibracyjnych; zwykle wystarczy 5-6 na płytkę dołka).
- Odpipetować 200 μl (13 μl dla płytek 384-dołkowych) żelu zawierającego NB powoli w dołkach miareczkowania płytki dołkowej i upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
nuta: Zastosowanie elektronicznych pipet lub robotyki znacznie zwiększa powtarzalność.
- Pozostawić żel do zestalenia się przez 10 minut w temperaturze pokojowej i kolejne 10 minut w temperaturze 4 °C (w razie potrzeby usunąć kondensację ze szkła). Upewnij się, że wszystkie te kroki wykonujesz na idealnie poziomej powierzchni, aby uniknąć niejednorodnych powierzchni żelowych.
nuta: Żele zawierające białko są zwykle stabilne przez co najmniej kilka godzin w temperaturze 4 °C.
5. Dodawanie rozwiązania DNA konkurencji
UWAGA: Następujące roztwory powinny być przygotowane przed rozpoczęciem miareczkowania i dodawane jednocześnie do dołków kalibracyjnych i miareczkowych.
- Dodaj wyżarzone, znakowane referencyjne DNA i białko w 3-krotnym buforze wiążącym o 3 razy wyższych stężeniach niż podwielokrotności żelu.
- Zmieszać 20 μl otrzymanego roztworu z 40 μl każdego wyżarzonego roztworu konkurencyjnego DNA otrzymanego w kroku 3.
- Dla każdej studzienki kalibracyjnej wymieszać 20 μl 3x buforu wiążącego zawierającego 15 mM roztworu NB z 40 μl wyżarzonego DNA konkurenta (odpowiednia jest dowolna sekwencja o tej samej długości).
nuta: W przypadku płytek 384-dołkowych należy użyć łącznie 21 μl zamiast 60 μl.
- Opcjonalnie należy sprawdzić spektroskopowo jednorodność poziomów wysokości żelu w różnych dołkach płytki, mierząc absorbancję przy 380 nm za pomocą wielodołkowego czytnika płytek (wartości absorbancji są proporcjonalne do wysokości żelu).
- Dodać 50 μl (7 μl dla formatu płytki 384-dołkowej) zmieszanych roztworów DNA konkurencji (wyżarzonych w kroku 3) na wierzch żeli. Spróbuj dodać wszystkie konkurencyjne rozwiązania tak równocześnie, jak to możliwe, używając elektronicznych pipet wielokanałowych lub 96-kanałowej głowicy pipetowej, jeśli jest dostępna. Po dodaniu konkurencyjnych rozwiązań umieść płytkę na stoliku mikroskopu i natychmiast rozpocznij pomiary.
6. Akwizycja obrazu
- Sekwencyjnie pobieraj szeregi czasowe stosów z (np. użyj 12 płaszczyzn i 100-300 ms czasu oświetlenia). Unikaj robienia zdjęć zbyt blisko powierzchni studni (< ~ 1,4 μm z płytkami użytymi w niniejszym dokumencie), aby wykluczyć jakiekolwiek odchylenie polaryzacji.
- Wykonaj 10-25 cykli pomiarów, aż do całkowitego rozwiązania znakowanego referencyjnego DNA z TF. Punkt końcowy jest zwykle osiągany po 1-2 godzinach, w zależności od kinetyki wiązania i dyfuzyjności konkurencyjnego DNA.
