1. Przygotowanie systemu
- Projektowanie plazmidów w miejscu wiązania
- Zaprojektuj kasetę miejsca wiązania, jak pokazano na rysunku 1. Każdy minigen zawiera następujące części (od 5' do 3'): miejsce restrykcji Eagl, ∼40 zasad końca 5' genu oporności na kanamycynę (Kan), promotor pLac-Ara, miejsce wiązania rybosomów (RBS), AUG genu mCherry, dystans (δ), miejsce wiązania RBP, 80 zasad końca 5' genu mCherry, oraz strona z ograniczeniami ApaLI.
nuta: Aby zwiększyć wskaźnik powodzenia testu, zaprojektuj trzy kasety z miejscem wiązania dla każdego miejsca wiązania, z przekładkami składającymi się z co najmniej jednej, dwóch i trzech podstaw. Więcej informacji na temat wyników można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki.
- Klonowanie plazmidów w miejscu wiązania
- Uporządkuj kasety miejsca wiązania jako minigeny dwuniciowego DNA (dsDNA). Każdy minigen ma długość ∼500 pz i zawiera miejsce restrykcji Eagl i miejsce restrykcyjne ApaLI odpowiednio na końcach 5' i 3' (patrz krok 1.1.1).
nuta: W tym eksperymencie mini-geny z połową genu kanamycyny zostały uporządkowane, aby ułatwić badania przesiewowe w kierunku dodatnich kolonii. Jednak montaż Gibsona jest również odpowiedni w tym przypadku, w którym to przypadku miejsce wiązania można uporządkować jako dwa krótsze komplementarne jednoniciowe oligonukleotydy DNA.
- Podwójnie trawić zarówno mini-geny, jak i wektor docelowy za pomocą Eagl-HF i ApaLI zgodnie z protokołem restrykcji, a następnie oczyścić kolumnę.
- Zliguj strawione minigeny do szkieletu miejsca wiązania zawierającego resztę genu reporterowego mCherry, terminatora i genu oporności na kanamycynę.
- Przekształć roztwór do ligacji w komórki Escherichia coli TOP10.
- Identyfikacja dodatnich transformantów za pomocą sekwencjonowania Sangera.
- Zaprojektuj starter 100 zasad przed obszarem zainteresowania (patrz Tabela 1, aby zapoznać się z sekwencjami starterów).
- Miniprzygotuj kilka kolonii bakterii.
- Przygotować 5 μl 5 mM roztworu startera i 10 μl DNA o stężeniu 80 ng/μl.
- Wyślij oba rozwiązania do wygodnego obiektu w celu sekwencjonowania Sangera.
- Oczyszczone plazmidy należy przechowywać w temperaturze -20 °C, a szczepy bakterii w postaci zapasów glicerolu, oba w formacie 96-dołkowym. DNA zostanie następnie wykorzystane do transformacji w komórki TOP10 E. coli zawierające jeden z czterech plazmidów fuzyjnych RBP (patrz krok 1.3.5).
- Projektowanie i budowa plazmidu RBP
UWAGA: Sekwencje aminokwasów i nukleotydów białek płaszcza użytych w tym badaniu są wymienione w tabeli 2.
- Uporządkuj wymaganą sekwencję RBP bez kodonu stop jako niestandardowo uporządkowany minigen dsDNA bez kodonu stop z miejscami restrykcyjnymi na końcach (ryc. 1).
- Sklonuj badany RBP pozbawiony kodonu stop bezpośrednio za indukowalnym promotorem i przed białkiem fluorescencyjnym pozbawionym kodonu start (Figura 1), podobnie jak w krokach 1.2.2-1.2.4. Upewnij się, że plazmid RBP zawiera inny gen oporności na antybiotyki niż plazmid miejsca wiązania.
- Zidentyfikuj transformanty dodatnie za pomocą sekwencjonowania Sangera, podobnie jak w kroku 1.2.5 (patrz Tabela 1 dla sekwencji starterów).
- Wybierz jeden pozytywny transformant i spraw, aby był kompetentny chemicznie. Przechowywać w postaci oczyszczonych plazmidów glicerolu w temperaturze -20 °C, a szczepów bakterii w glicerolu w temperaturze -80 °C na płytkach 96-dołkowych.
- Przekształć plazmidy w miejscu wiązania (z kroku 1.2.6) przechowywane w 96-dołkowych płytkach w chemicznie kompetentne komórki bakteryjne zawierające już plazmid RBP-mCerulean. Aby zaoszczędzić czas, zamiast posiewać komórki na szalkach Petriego, posmaruj je za pomocą 8-kanałowego pipetora na 8-pasmowych płytkach zawierających agar Luria-Bertani (LB) z odpowiednimi antybiotykami (Kan i Amp). Rodziny powinny pojawić się w ciągu 16 godzin.
- Wybierz pojedynczą kolonię dla każdego podwójnego transformantu i hoduj przez noc w pożywce LB z odpowiednimi antybiotykami (Kan i Amp) i przechowuj jako zapasy glicerolu w temperaturze -80 °C na 96-dołkowych płytkach.
2. Konfiguracja eksperymentu
UWAGA: Przedstawiony tutaj protokół został wykonany przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy w połączeniu z inkubatorem i czytnikiem płytek. Każdy pomiar przeprowadzono dla 24 stężeń induktora, z dwoma duplikatami dla każdej kombinacji szczep + induktor. Za pomocą tego zrobotyzowanego systemu zebrano dane dla 16 szczepów dziennie o 24 stężeniach induktorów. Jeśli jednak takie urządzenie jest niedostępne lub jeśli potrzeba mniej eksperymentów, można je łatwo wykonać ręcznie za pomocą 8-kanałowej pipety wielokanałowej i odpowiednio dostosowując protokół. Na przykład w ten sposób uzyskano wstępne wyniki dla czterech szczepów dziennie z 12 stężeniami induktora i czterema punktami czasowymi.
- Przygotuj wcześniej 1 l buforu do testu biologicznego (BA), mieszając 0,5 g tryptonu, 0,3 ml glicerolu, 5,8 g NaCl, 50 ml 1 M MgSO4, 1 ml 10x buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4 i 950 ml podwójnie destylowanej wody (DDW). Autoklaw lub sterylny filtr buforu BA.
- Szczepy z podwójną transformacją należy hodować w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min, wytrząsając w 1,5 ml LB z odpowiednimi antybiotykami (kanamycyna w końcowym stężeniu 25 μg/ml i ampicylina w końcowym stężeniu 100 μg/ml), na 48-dołkowych płytkach, przez okres 18 godzin (przez noc).
- Rano przygotuj następujące preparaty.
- Płytka induktora. Na czystej 96-dołkowej płytce przygotować studzienki z podłożem półubogim (SPM) składającym się z 95% BA i 5% LB26 w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Liczba studzienek odpowiada pożądanej liczbie stężeń induktora. Dodaj C4-HSL do studzienek w płytce induktora, które będą zawierały najwyższe stężenie induktora (218 nM).
- Zaprogramuj robota tak, aby seryjnie rozcieńczał medium z każdej ze studni o najwyższym stężeniu do 23 niższych stężeń w zakresie od 0 do 218 nM. Objętość każdego rozcieńczenia induktora powinna być wystarczająca dla wszystkich szczepów (w tym duplikatów).
- Podczas przygotowywania rozcieńczeń induktora należy ogrzać 180 μl SPM w inkubatorze w temperaturze 37 °C na płytkach 96-dołkowych.
- Rozcieńczyć nocne szczepy z kroku 2.2 przez współczynnik 100 przez seryjne rozcieńczenia: najpierw rozcieńczyć 10-krotnie przez zmieszanie 100 μl bakterii z 900 μl SPM na płytkach 48-dołkowych, a następnie ponownie rozcieńczyć 10-krotnie, pobierając 20 μl z rozcieńczonego roztworu do 180 μl wstępnie podgrzanego SPM, w 96-dołkowych płytkach odpowiednich do pomiarów fluorescencyjnych.
- Dodać rozcieńczony induktor z płytki induktora do 96-dołkowych płytek z rozcieńczonymi szczepami zgodnie z końcowymi stężeniami.
- Potrząsać 96-dołkowymi płytkami w temperaturze 37 °C przez 6 godzin, wykonując pomiary gęstości optycznej przy fluorescencji 595 nm (OD595), mCherry (560 nm/612 nm) i mCerulean (460 nm/510 nm) za pomocą czytnika płytek co 30 minut. W celu normalizacji zmierz wzrost SMP bez dodawania komórek.
