1. Dzień 9 (rano): Rozpocznij hodowlę do pomiaru enzymatycznego.
- Ponownie zawiesić hodowlę i przenieść 125 μl za pomocą pipety wielokanałowej na płytce spektrofotometru (zmierzyć OD600).
nuta: Ostrzeżenie: Nie dozuj ostatniej kropli, aby uniknąć pęcherzyków, jeśli OD600 jest poniżej 0,3 - 0,6, inkubuj pozostałe komórki przez 1 - 2 godziny więcej w zależności od odczytu. Kultura o pojemności 125 μl użyta na tym etapie może zostać odrzucona lub przeniesiona z powrotem do pierwotnego bloku studni głębinowej według uznania użytkownika.
- Odwirować pozostałe komórki w bloku studzienki głębinowej przez 10 minut w temperaturze 3000 x g i temperaturze 21 °C. Usunąć supernatant przez odwrócenie.
- Dodać 200 μl buforu Z i vortex.
nuta: Proszę zapoznać się z przepisem na bufor Z w Tabeli 1.
- Wirować przez 5 minut w temperaturze 3000 x g i temperaturze 21 °C. Usunąć supernatant przez odwrócenie.
- Dodać 20 μl buforu Z i odwirować.
- Przykryj płytkę folią uszczelniającą, która jest odporna na cykle zamrażania i rozmrażania. Wykonać 4 cykle zamrażania/rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu w dygestorium, a następnie w temperaturze 42 ºC w łaźni wodnej (2 minuty każdy).
- Dodaj 200 μl buforu Z/beta-merkaptoetanolu (β-ME)/orto-nitrofenylo-β-galaktozydu (ONPG) (odpowiednio 12 ml, 21 μl, 8,4 mg da 20 ml roztworu; zawsze przygotowuj świeży).
nuta: ONPG zajmie trochę czasu, aby prawidłowo się rozpuścić, więc przygotuj roztwór na godzinę przed osiągnięciem tego etapu. ONPG służy jako substrat do pomiaru aktywności β-galaktozydazy.
- Inkubować do 17 - 24 godzin w temperaturze 30 °C (sprawdź w międzyczasie, czy kolor rozwinął się wcześniej, przejdź do następnego etapu).
2. Dzień 10 (rano): Przerwij reakcję i zmierz.
- Dodaj 110 μL 1M Na2CO3 aby zatrzymać reakcję i zapisać czas.
- Wirować i wirować przez 10 minut w temperaturze 3000 x g i temperaturze 21 °C.
- Pobrać 125 μl supernatantu za pomocą wielokanałowego i zmierzyć OD420,
nuta: Uwaga, nie dozuj ostatniej kropli, aby uniknąć bąbelków.
Tabela 1: Wzór na roztwory użyte w protokole. Tabela zawiera przepis na roztwory podstawowe i robocze głównych użytych w teście.
| Bufor TE 10X (10ml) | |
| pożądany | Z magazynu |
| 1000mM Tris-Cl (pH 8,0) | 1 ml Tris 1M |
| 10mM EDTA (pH 8,0) | 200uL EDTA 0,5M |
| Uzupełnić objętość wodą | |
| TE/LiAc (10 ml) | |
| pożądany | Z magazynu |
| 1X | 1 ml TE 10X |
| Akumulator LiAc 0,1 m | 1 ml LiAc 1M |
| Uzupełnić objętość wodą | |
| TE/LiAc/PEG (50 ml) 50% | |
| pożądany | Z magazynu |
| 1X | 5 ml TE 10X |
| Akumulator LiAc 0,1 m | 5 ml LiAc 1M |
| 40 ml PEG3350 | |
| Bufor Z (1L) pH 7,0 | |
| Na2HPO4 16,1 g siedmiowodnego lub 8,52 g bezwodnego |
| NaH2PO4 5,5 g uwodnionego lub 4 g bezwodnego |
| KCl 0.75g |
| MgSO4 0,246 g uwodnionego lub 0,12 g bezwodnego |
| Utrzymuj pH za pomocą HCl |
| Wszystkie roztwory są sterylizowane przed użyciem. |
| Podłoża i płytki agarowe używane w protokole (YPDA, SD-Ura; SD-Trp-Ura i SD-Trp-Ura) są zgodne z tą samą recepturą, co w Y1H |
