Zmodyfikowany test hybrydowy drożdży i jeden do wykrywania interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA

Streszczenie

Źródło: Tripathi, P. et al., Zmodyfikowany hybrydowy system drożdży i jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i DNA. J. Vis. Exp. (2017)

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany test hybrydowy drożdży, który wykrywa wiele białek oddziałujących z docelowym DNA. Przekształcone komórki drożdży zawierają docelową sekwencję DNA przed genem reporterowym. Dodatkowo wykazują ekspresję białek czynnika transkrypcyjnego. Kiedy białka tworzą kompleksy i wiążą się z docelowym DNA, gen reporterowy ulega ekspresji i może być wykryty enzymatycznie.

Protokół

1. Dzień 9 (rano): Rozpocznij hodowlę do pomiaru enzymatycznego.

1. Ponownie zawiesić hodowlę i przenieść 125 μl za pomocą pipety wielokanałowej na płytce spektrofotometru (zmierzyć OD₆₀₀).
   nuta: Ostrzeżenie: Nie dozuj ostatniej kropli, aby uniknąć pęcherzyków, jeśli OD₆₀₀ jest poniżej 0,3 - 0,6, inkubuj pozostałe komórki przez 1 - 2 godziny więcej w zależności od odczytu. Kultura o pojemności 125 μl użyta na tym etapie może zostać odrzucona lub przeniesiona z powrotem do pierwotnego bloku studni głębinowej według uznania użytkownika.
2. Odwirować pozostałe komórki w bloku studzienki głębin....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96-dołkowa płyta z okrągłym dnem	Greiner bio-one	650101	Wyroby z tworzyw sztucznych
Blok studni o głębokości 96	USA Naukowe	Lata 1896-2000	Wyroby z tworzyw sztucznych
Folia zgrzewalna	USA Naukowe	2923-0110	Wyroby z tworzyw sztucznych
Pieczęć Araseal	Excel Naukowy	B-100	Wyroby z tworzyw sztucznych
2-merkaptoetanol	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 034461-100	Test
ONPG (Protokół ONPG	Sigma-Aldrich	Numer telefonu 73660	Test
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223484	Test
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S3264	Test
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S3139	Test
Kcl	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP366-500	Test
MgSO4	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 83266	Test
Hcl	Fisher Naukowy	Zobacz materiał SA54-4	Test
Sucha kąpiel	Termo Fischer		urządzenie
wir	Termo Fischer		urządzenie
wirówka	Eppendorf	Wirówka 5810R	urządzenie
Czytnik płyt	Urządzenie molekularne	Spektrofotometr mikropłytkowy SPECTRAMAX PLUS	urządzenie
inkubator	Rybak termiczny	Model nr 5250-37 stopni, 6250-30 stopni	urządzenie
Inkubator z wytrząsarką	Nowy Brunszwik		urządzenie
Kąpiel wodna	Rybak termiczny	IsoTemp 205	urządzenie
Baza Tris	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-1	Test

) TGL powiedział: