Pomiar aktywności helikazy białka docelowego za pomocą dupleksów RNA znakowanych biotyną

Streszczenie

Źródło: Yu, L. et al., Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy. J. Vis. Exp. (2019)

W tym filmie demonstrujemy procedurę określania aktywności helikazy docelowego białka w celu rozwinięcia znakowanego biotyną substratu dsRNA. Aktywność enzymu zidentyfikowano poprzez analizę przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej, a następnie test chemiluminescencyjny przy użyciu chemiluminescencyjnej streptawidyny sprzężonej z enzymem.

Protokół

1. Preparat białkowy

1. Konstrukcje wyrażeń MOV10
   1. Wygeneruj konstrukty ekspresji cDNA kodujące mysz MOV10.
      1. Ustaw reakcje reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) dla każdego fragmentu. Wymieszać 1 μl mysiego cDNA (z jądra myszy C57BL/6), 1 μl dNTP, 2 μl 10 μM startera do przodu, 2 μL 10 μM startera wstecznego, 1 μL polimerazy DNA, 25 μL buforu 2x PCR i 18 μL podwójnie destylowanego_H2O(ddH₂O) w końcowej objętości 50 μL.
         nuta: Startery do amplifikacji fragmentów genu Mov10 wymieniono w Tabeli 1.
      2. Reakcje PCR należy przeprowadzić przy użyci....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
sprzęt
wirówka	Eppendorf, Niemcy	Zobacz materiał 5242R
System obrazowania chemiluminescencyjnego	Tanon, Chińska Republika Ludowa	5200
Sonifer cyfrowy	Branson, Stany Zjednoczone	BBV12081048A	450 W; 50/60 HZ
Półsucha bibuła elektroforetyczna	Hoefer, Stany Zjednoczone	TE77XP
Rewolwer rurowy	Crystal, Stany Zjednoczone	3406051
Sieciowanie światłem UV	UVP, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał CL-1000
Materiałów
Membrana nylonowa	Thermo Scientific, Stany Zjednoczone	TG263940A
Naczynie hodowlane poddane działaniu TC	Corning, Stany Zjednoczone	430167	Szerokość 100 mm
Naczynie hodowlane poddane działaniu TC	Corning, Stany Zjednoczone	430597	150 mm
Rurki do mikroprobówek	AXYGEN, Stany Zjednoczone Ameryki	MCT-150-C	1,5 ml
Rury	Corning, Stany Zjednoczone	430791	15 ml
Odczynniki
Koraliki magnetyczne Anti-FLAG M2	Sigma, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał M8823
Atp	Thermo Scientific, Stany Zjednoczone	591136
Zestaw do rozwoju koloru fosfatazy alkalicznej BCIP / NBT	Beyotime, Chińska Republika Ludowa	Zobacz materiał C3206
CelLyticTM M Odczynnik do lizy komórek	Sigma, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 107M4071V
Jednoetapowy zestaw do klonowania ClonExpress II	Vazyme, Chińska Republika Ludowa	Zobacz materiał C112
Zestaw do wykrywania chemiluminescencyjnych kwasów nukleinowych	Thermo Scientific, Stany Zjednoczone	T1269950
Protokół dNTP	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	DNTP100-1KT
DMEM (DMEM)	Gibco, Stany Zjednoczone Ameryki	10569044
Edta	Invitrogen, Stany Zjednoczone	AM9260G	0,5 mln
Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA	Roche, Stany Zjednoczone	4693132001
Zestaw plazmidowy EndoFree Maxi	Vazyme, Chińska Republika Ludowa	Kontroler DC202
Minizestaw do ekstrakcji DNA w żelu FastPure	Vazyme, Chińska Republika Ludowa	DC301-01
FBS (Sieć Usługowa	Gibco, Stany Zjednoczone Ameryki	10437028
Peptyd FLAG	Sigma, Stany Zjednoczone	F4799
glicerol	Sigma, Stany Zjednoczone	SHBK3676
Bufor HEPES	Sigma, Stany Zjednoczone	SLBZ2837	1 mln
KOAc	Sangon Biotech, Chiny	127-08-02
MgCl2	Invitrogen, Stany Zjednoczone	AM9530G	1 mln
Zawartość NaCl	Invitrogen, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał AM9759	5 mln
NP-40	Amresco, Stany Zjednoczone Ameryki	Zobacz materiał M158-500ML
Podłoże Opti-MEM	Gibco, Stany Zjednoczone Ameryki	31985062
Pbs	Gibco, Stany Zjednoczone Ameryki	10010023	Odczyn pH 7,4
Inhibitor RNazy	Promega, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał N251B
Fosfataza alkaliczna streptawidyny	Promega, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał V5591
KZM	Invitrogen, Stany Zjednoczone	15581044
Bufor Tris-HCI	Invitrogen, Stany Zjednoczone	15567027	1 M, pH 7,4
Bufor Tris-HCI	Invitrogen, Stany Zjednoczone	15568025	1 M, pH 8,0
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Sangon Biotech, Chiny	A600560

szt. Ameryki Ameryki Ameryki Ameryki Ameryki powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: