Pomiar aktywności helikazy białka docelowego za pomocą dupleksów RNA znakowanych biotyną

Streszczenie

Źródło: Yu, L. et al., Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy. J. Vis. Exp. (2019)

W tym filmie demonstrujemy procedurę określania aktywności helikazy docelowego białka w celu rozwinięcia znakowanego biotyną substratu dsRNA. Aktywność enzymu zidentyfikowano poprzez analizę przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej, a następnie test chemiluminescencyjny przy użyciu chemiluminescencyjnej streptawidyny sprzężonej z enzymem.

Protokół

1. Preparat białkowy

1. Konstrukcje wyrażeń MOV10
   1. Wygeneruj konstrukty ekspresji cDNA kodujące mysz MOV10.
      1. Ustaw reakcje reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) dla każdego fragmentu. Wymieszać 1 μl mysiego cDNA (z jądra myszy C57BL/6), 1 μl dNTP, 2 μl 10 μM startera do przodu, 2 μL 10 μM startera wstecznego, 1 μL polimerazy DNA, 25 μL buforu 2x PCR i 18 μL podwójnie destylowanego_H2O(ddH₂O) w końcowej objętości 50 μL.
         nuta: Startery do amplifikacji fragmentów genu Mov10 wymieniono w Tabeli 1.
      2. Reakcje PCR należy przeprowadzić przy użyciu następujących programów: 95 °C przez 5 min, 35 cykli ogrzewania w temperaturze 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 64 °C przez 15 s, wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 20 s (2 minuty w przypadku wydłużenia MOV10 na całej długości) i końcowe wydłużenie w temperaturze 68 °C przez 7 min.
   2. Przeanalizuj amplifikowane DNA PCR za pomocą elektroforezy żelowej, szybko odetnij pasmo o wymaganym rozmiarze z żelu pod lampą UV i umieść go w probówce wirówkowej.
      nuta: Przewidywany rozmiar produktu widoczny na żelu agarozowym dla MOV10 to 3015 pz.
   3. Oczyść DNA PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.
      1. Dodać równą objętość buforu do rozpuszczania do probówki wirówkowej z kroku 1.1.2 i stopić żel w łaźni wodnej o temperaturze 50-55 °C przez 5-10 minut, upewniając się, że kawałki żelu całkowicie się stopią. Odwirować na krótko, aby zebrać wszelkie kropelki ze ścianki probówki.
         nuta: Stężenie masowe/objętościowe żelu i buforu do rozpuszczania wynosi 1 mg/μl.
      2. Umieścić kolumnę adsorpcyjną w probówce zbiorczej, przenieść roztwór zawierający rozpuszczony fragment żelu do kolumny adsorpcyjnej i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty.
      3. Wyrzucić filtrat znajdujący się na dnie probówek zbiorczych. Dodać 600 μl buforu do przemywania do kolumny, odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę i wyrzucić filtrat.
      4. Powtórz krok 1.1.3.3 jeden raz.
      5. Umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty, aby usunąć cały pozostały bufor do płukania.
      6. Umieścić kolumnę adsorpcyjną w wysterylizowanej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodać 50 μl ddH₂O do środka kolumny adsorpcyjnej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min. Zmierzyć stężenie DNA w eluacie za pomocą spektrofotometru.
   4. Trawienie restrykcyjne plazmidów
      1. Trawić wektor pRK5 z BamHI i XhoI, mieszając 4 μg wektora pRK5, 5 μl 10-krotnego buforu do wytrawiania, 1 μL BamHI i 1 μL XhoI i ddH₂O do końcowej objętości reakcji 50 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
   5. Przeanalizuj DNA wektora za pomocą elektroforezy żelowej, szybko odetnij pożądany rozmiar pasma z żelu za pomocą skalpela pod lampą UV i umieść go w probówce wirówkowej.
   6. Oczyścić DNA wektora za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu jak w ppkt 1.1.3, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
   7. Ustawić standardową reakcję ligacji rekombinowanej, łącząc 0,03 pmol zlinearyzowanego wektora, 0,06 pmol fragmentu cDNA, 2 μl ligazy i 4 μl 5x buforu ligazy i ddH₂O w końcowej objętości reakcji 10 μL.
      nuta: Sklonuj MOV10 do wektora pRK5.
   8. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie natychmiast schłodzić reakcję przez 5 minut na lodzie. Przekształć rekombinowane plazmidy MOV10 w bakterie DH5α.
      nuta: Sprawdź wszystkie rekombinowane konstrukty za pomocą sekwencjonowania Sangera.
   9. Przygotować zapasy glicerolu w kulturach bakteryjnych zawierających zweryfikowane rekombinowane plazmidy, dodając równą objętość 50% glicerolu do płynnych kultur i przechowując w temperaturze -80 °C.
      nuta: W każdym kolejnym eksperymencie należy wyrzucić bakterie z zapasów glicerolu na świeżą płytkę agarową i użyć pojedynczej kolonii do ekspansji, jak opisano w kroku 1.2.
2. Ekstrakty białkowe MOV10 z komórek HEK293T
   1. Przejściowo ulega ekspresji białek MOV10 w hodowanych komórkach HEK293T.
      1. Przygotować plazmid MOV10-pRK5 o stężeniu >500 ng/μL.
      2. Nasiona HEK293T komórki w 15 cm szalkach. Gdy gęstość komórek osiągnie ~ 70%-90%, zastąp pożywkę do hodowli komórkowej świeżą zmodyfikowaną pożywką Dulbecco's Modify Eagle Medium (DMEM) zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny.
      3. W przypadku jednej transfekcji rozcieńczyć 60 μg plazmidowego DNA MOV10-pRK5 w 3 ml zredukowanej pożywki surowicy, a następnie dodać 120 μl odczynnika wzmacniającego transfekcję i dobrze wymieszać.
      4. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 90 μl odczynnika do transfekcji 3 ml zredukowanej pożywki surowicy (bez penicyliny-streptomycyny) i dobrze wymieszać.
      5. Dodać rozcieńczone DNA do każdej probówki z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
      6. Dodaj mieszaninę transfekcji do hodowli komórkowej i hoduj komórki przez ~36-48 godzin.
   2. Po 36-48 godzinach zebrać komórki z każdej płytki do probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć każdą osadkę 10 ml lodowatego PBS i zebrać komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy komórek zawierającego kompletny koktajl inhibitorów proteazy wolny od kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować przez 30 minut na lodzie. Odwirować lizat przy 20 000 x g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   4. Dodaj 100 μl kulek magnetycznych anty-FLAG na miskę komórek w probówce o pojemności 1,5 ml.
   5. Przemyj kulki magnetyczne 2x buforem K150 (50 mM HEPES przy pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
      1. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne w 1 ml lodowatego buforu K150.
      2. Inkubować kulki magnetyczne przez 2 minuty w temperaturze 4 °C z delikatnym obracaniem i granulować kulki magnetyczne za pomocą magnesu. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
   6. Dodać kulki magnetyczne do supernatantu lizatu komórkowego z etapu 1.3.3 i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
   7. Przemyć kulki magnetyczne związane z białkami 3x buforem K150, następnie 2x K150 zawierającym 250 mM NaCl, a następnie 3x buforem K150 jak 1.3.5.
   8. Ponownie zawiesić kulki w 300 μl buforu elucyjnego FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl przy pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 10% glicerolu), dodać peptyd FLAG do końcowego stężenia 0,5 μg/μL i inkubować z kulkami na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, a następnie granulować kulki magnetyczne za pomocą magnesu.
   9. Zebrać supernatant zawierający eluowane białka MOV10, oznaczyć stężenie i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

2. Przygotowanie kwasu nukleinowego

1. Kupuj oligonukleotydy DNA i RNA z etykietami biotyny lub bez nich z odpowiedniego źródła. Rozcieńczyć każdy oligo w wolnym od RNaz ddH₂O do 20 μM i utrzymywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
   nuta: Oligonukleosekwencje substratów DNA/RNA użyte w tym badaniu zestawiono w tabeli 2.
2. Przygotować następującą mieszaninę do reakcji wyżarzania dwuniciowego RNA (dsRNA) do oznaczania aktywności helikazy MOV10: zmieszać 60 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-etanosulfonowego (HEPES) o pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl₂ i ddH₂O wolnym od RNaz w końcowej objętości reakcji 20 μL.
3. Oligonukleotydy wyżarzanego RNA tworzą dupleks RNA przez ogrzewanie mieszaniny górnej nici znakowanej biotyną (2 μM, stężenie końcowe) i 1,5-krotności jej nieznakowanej komplementarnej dolnej nici w buforze do wyżarzania (krok 2.2) w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie powoli schładzanie do temperatury pokojowej (RT).

3. Testy biochemiczne in vitro

1. EMSA i reakcje enzymatyczne
   1. Do oznaczania aktywności helikazy MOV10 zmieszać 50 mM Tris-HCl przy pH 7,5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl₂, 0,01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μL inhibitora RNazy, 10 nM substratu RNA znakowanego biotyną, 2 mM trifosforanu adenozyny (ATP), pułapki 100 nM RNA oraz 20 ng białka MOV10 i ddH₂O w końcowej objętości reakcji 20 μL. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min, 30 min i 60 min. Dodaj 5-krotny bufor zatrzymujący, aby zatrzymać reakcję.
      nuta: Pułapka RNA, nieznakowany biotyną oligo z sekwencją, komplementarność do znakowanego oligo, co zapobiega ponownemu wyżarzaniu odwiniętego dsRNA.
2. Żele poliakrylamidowe
   1. Umyj płytki żelowe (16 cm x 16 cm) i grzebienie 1,5 mm. Zmontuj jednostki do elektroforezy żelowej.
   2. Aby przygotować 10% natywny żel poliakrylamidowy, wymieszaj 14 ml ddH₂O, 1,25 ml 10x kwas tris-borowy EDTA (TBE), 8,3 ml 30% akrylamidu, 1,25 ml 50% glicerolu, 187,5 μl 10% świeżo przygotowanego nadsiarczanu amonu (APS) i 12,5 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).
   3. Aby przygotować 20% natywny żel poliakrylamidowy, wymieszaj 5,5 ml ddH₂O, 1,25 ml 10x TBE, 1,25 ml 50% glicerolu, 16,7 ml 30% akrylamidu, 187,5 μl 10% APS i 12,5 μl TEMED.
   4. Roztwór akrylamidu należy natychmiast wlać do żelu i włożyć grzebień. Pozostaw mieszaninę do polimeryzacji przez około 30 minut.
3. Bieganie w żelu
   1. Wyjmij grzebień i napełnij zbiorniki buforem do elektroforezy (0,5x TBE).
   2. Przepłukać studzienki próbki buforem 0,5x TBE, a następnie wstępnie uruchomić żel pod napięciem 100 V na lodzie przez 30 minut. Zastąp działający bufor nowym buforem 0,5x TBE.
   3. Załaduj 20-25 μl próbek do każdej studzienki.
   4. Do testów EMSA należy użyć 10% natywnego żelu akryloamidowego i 20% natywnego żelu akryloamidowego do testów enzymatycznych. Przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 100 V w łaźni lodowej, aż niebieski marker bromofenolu przeniesie się do dolnej ćwiartki żelu.
4. Zdemontuj płytki żelowe i przytnij żel, usuwając studnie załadunkowe i nieużywane pasy. Umieść żel w 0,5 buforze TBE.
5. Przyciąć bibułę filtracyjną i nylonową membranę do rozmiaru żelu. Wstępnie zwilż czystą bibułę filtracyjną i nylonową membranę.
6. Złóż stos do przeniesienia.
   1. Umieść wstępnie zwilżoną membranę na wstępnie zwilżonej bibule filtracyjnej.
   2. Umieść żel na membranie.
   3. Przykryj żel kolejną warstwą wstępnie zwilżonej bibuły filtracyjnej.
   4. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza, zwijając czystą pipetę od środka do krawędzi.
7. Przenieść próbki z żelu na membranę w półsuchym aparacie elektroforetycznym o natężeniu 90 mA przez 20 minut.
8. Przerwij przenoszenie, a następnie wysusz membranę na nowej bibule filtracyjnej przez 1 minutę.
9. Sieciowanie próbek poprzez naświetlanie membrany napięciem 120 mJ/^cm2 przez 45-60 s w sieciowniku wykorzystującym światło UV wyposażonym w żarówki o długości fali 254 nm (funkcja automatycznego sieciowania). Suszyć membranę na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
10. Detekcja chemiluminescencji
    1. Protokół 1: Użyj standardowej objętości komercyjnego zestawu do wykrywania chemiluminescencyjnych kwasów nukleinowych.
       1. Dodać 20 ml buforu blokującego do membrany i inkubować przez 15-30 minut, delikatnie wstrząsając rotatorem przy 20-25 obr./min.
       2. Przygotować sprzężony/blokujący roztwór buforowy, dodając 66,7 μl stabilizowanego koniugatu streptawidyny i peroksydazy chrzanowej do 20 ml buforu blokującego.
       3. Delikatnie usuń bufor blokujący i zastąp go buforem sprzężonym/blokującym. Inkubować przez 15 minut na rotatorze przy 20-25 obr./min.
       4. Umyj membranę 4x wstrząsając z prędkością 40-45 obr./min przez 5 min każde.
       5. Dodać 30 ml buforu równoważącego substrat do membrany. Inkubować membranę przez 5 minut, wytrząsając z prędkością 20-25 obr./min.
       6. Przygotować roztwór roboczy substratu, dodając 6 ml roztworu luminolu/wzmacniacza do 6 ml stabilnego roztworu nadtlenku. Unikaj światła.
       7. Pokryć całą powierzchnię membrany roztworem roboczym substratu i inkubować przez 5 minut.
       8. Skanuj membranę w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego przez 1-3 s.

Tabela 1: Startery używane do PCR amplifikują fragmenty genów Meiob i Mov10.Pogrubione litery w starterach do przodu i do tyłu to miejsca cięcia BamHI i NotI; kursywa pogrubione litery w odwróconym starterze to miejsca cięcia XhoI; pogrubione litery w polach wskazują nukleotydy odpowiadające mutacji punktowej R235A.

Fragmenty	Podkłady	Sekwencje (od 5' do 3')
MEIOB-A	naprzód	CGGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	rewers	ATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-C	naprzód	CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA
	rewers	CGATGCGGCCGCCTCTTTTATTTTCTCTTATATAATTCAGAGTAG
MEIOB-E	naprzód	CCGCGTGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	rewers	CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-E-mut	naprzód	CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC
	rewers	GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG
MOV10	naprzód	GACGACGATGACACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC
	rewers	GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG

Tabela 2: Sekwencje substratów DNA/RNA wykorzystane w tej pracy.

5'-Biotyna-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

Dla figur	Nazwy	Sekwencje (od 5' do 3')
Rysunek 2, 5	36 nt ssDNA
Wykres 3	36 nt ssRNA	5'-Biotyna-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU-3' (RNA)
Wykres 4	54 nt 5'-ogoniaste dsRNA	5'-Biotyna-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (RNA) 5'-ACGAGGACGAGGAGGAGACGGAGCGACGGCAGCGGU-3'(RNA)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
sprzęt
wirówka	Eppendorf, Niemcy	Zobacz materiał 5242R
System obrazowania chemiluminescencyjnego	Tanon, Chińska Republika Ludowa	5200
Sonifer cyfrowy	Branson, Stany Zjednoczone	BBV12081048A	450 W; 50/60 HZ
Półsucha bibuła elektroforetyczna	Hoefer, Stany Zjednoczone	TE77XP
Rewolwer rurowy	Crystal, Stany Zjednoczone	3406051
Sieciowanie światłem UV	UVP, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał CL-1000
Materiałów
Membrana nylonowa	Thermo Scientific, Stany Zjednoczone	TG263940A
Naczynie hodowlane poddane działaniu TC	Corning, Stany Zjednoczone	430167	Szerokość 100 mm
Naczynie hodowlane poddane działaniu TC	Corning, Stany Zjednoczone	430597	150 mm
Rurki do mikroprobówek	AXYGEN, Stany Zjednoczone Ameryki	MCT-150-C	1,5 ml
Rury	Corning, Stany Zjednoczone	430791	15 ml
Odczynniki
Koraliki magnetyczne Anti-FLAG M2	Sigma, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał M8823
Atp	Thermo Scientific, Stany Zjednoczone	591136
Zestaw do rozwoju koloru fosfatazy alkalicznej BCIP / NBT	Beyotime, Chińska Republika Ludowa	Zobacz materiał C3206
CelLyticTM M Odczynnik do lizy komórek	Sigma, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 107M4071V
Jednoetapowy zestaw do klonowania ClonExpress II	Vazyme, Chińska Republika Ludowa	Zobacz materiał C112
Zestaw do wykrywania chemiluminescencyjnych kwasów nukleinowych	Thermo Scientific, Stany Zjednoczone	T1269950
Protokół dNTP	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	DNTP100-1KT
DMEM (DMEM)	Gibco, Stany Zjednoczone Ameryki	10569044
Edta	Invitrogen, Stany Zjednoczone	AM9260G	0,5 mln
Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA	Roche, Stany Zjednoczone	4693132001
Zestaw plazmidowy EndoFree Maxi	Vazyme, Chińska Republika Ludowa	Kontroler DC202
Minizestaw do ekstrakcji DNA w żelu FastPure	Vazyme, Chińska Republika Ludowa	DC301-01
FBS (Sieć Usługowa	Gibco, Stany Zjednoczone Ameryki	10437028
Peptyd FLAG	Sigma, Stany Zjednoczone	F4799
glicerol	Sigma, Stany Zjednoczone	SHBK3676
Bufor HEPES	Sigma, Stany Zjednoczone	SLBZ2837	1 mln
KOAc	Sangon Biotech, Chiny	127-08-02
MgCl2	Invitrogen, Stany Zjednoczone	AM9530G	1 mln
Zawartość NaCl	Invitrogen, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał AM9759	5 mln
NP-40	Amresco, Stany Zjednoczone Ameryki	Zobacz materiał M158-500ML
Podłoże Opti-MEM	Gibco, Stany Zjednoczone Ameryki	31985062
Pbs	Gibco, Stany Zjednoczone Ameryki	10010023	Odczyn pH 7,4
Inhibitor RNazy	Promega, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał N251B
Fosfataza alkaliczna streptawidyny	Promega, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał V5591
KZM	Invitrogen, Stany Zjednoczone	15581044
Bufor Tris-HCI	Invitrogen, Stany Zjednoczone	15567027	1 M, pH 7,4
Bufor Tris-HCI	Invitrogen, Stany Zjednoczone	15568025	1 M, pH 8,0
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Sangon Biotech, Chiny	A600560

szt. Ameryki Ameryki Ameryki Ameryki Ameryki powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: