Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

Streszczenie

Źródło: de la Peña Avalos, B., et al., Wizualizacja interakcji białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji. J. Vis. Exp. (2020).

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Protokół

1. Ekstrakcja jądrowa i utrwalanie komórek

1. Przygotować roztwory podstawowe: 0,2 M RURY (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M sacharozy, 1 M MgCl₂, 0,1 M EGTA (pH 8,0).
2. Przygotować jądrowy bufor ekstrakcyjny (NEB): rozpuścić 10 mM RUR (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA (pH 8,0) i 0,5% (v/v) Triton X-100 w ddH₂O. Mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia.
3. Przygotować 4% (v/v) paraformaldehyd (PFA): rozpuścić 10 ml 16% wodnego roztworu PFA w 30 ml PBS. Mieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia.
4. W odpowiednim momencie (t=0, 1, 2, 4, 16 h) przemyj komórki dwukrotnie 1 ml PBS. Całkowicie usuń PBS.
5. Dodać 200 μl NEB do każdej studzienki w celu ekstrakcji jąder komórkowych (cytoplazma ulega degradacji, pozostaje tylko jądro) (ryc. 1). Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i całkowicie usunąć.
   nuta: Nie przekraczaj 2 minut.
6. Umyj komórki 1 ml PBS. Całkowicie usuń PBS. Ostrożnie dodawaj PBS, na tym etapie komórki są bardzo delikatne.
7. Dodaj 200 μl 4% (v/v) PFA do każdego dołka w celu utrwalenia komórek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć PFA.
8. Dodać 1 ml PBS.
   nuta: Komórki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C.

2. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Przygotować roztwór blokujący: rozpuścić 5% BSA (w/v) w PBS i dodać 0,3% (v/v) Triton X-100. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
2. Przygotować bufor rozcieńczający: rozpuścić 1% BSA (w/v) w PBS i dodać 0,3% (v/v) Triton X-100. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
3. W celu zablokowania dodaj 200 μl roztworu blokującego do każdej studzienki. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 16-18 godzin w temperaturze 4 °C.
   nuta: Jeśli zostanie użyte przeciwciało kozie, dodaj 5% surowicy koziej do roztworu blokującego.
4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w buforze rozcieńczającym (1:500; lista przeciwciał znajduje się w Tabeli 1) i wirować aż do dobrego wymieszania.
   nuta: W przypadku stosowania przeciwciała koziego dodać 1% surowicy koziej do buforu rozcieńczającego.
5. W pojemniku do nawilżania/inkubacji przyklej kawałek parafilmu. Dodać 10 μl przeciwciała pierwszorzędowego (w jednej kropli). Dopasuj jedną krawędź szkiełka nakrywkowego do kropli i powoli opuść na parafilm, aby płyn rozprowadził się po całym ciele (jeśli to możliwe, unikaj pęcherzyków). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
6. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy w PBS przez 1 minutę.
7. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze rozcieńczającym (końcowe stężenie: 2 μg/ml) i wirować aż do dobrego wymieszania.
8. Zastosować 10 μl przeciwciał drugorzędowych zgodnie z opisem dla przeciwciał pierwszorzędowych. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   nuta: Chronić przed światłem.

Tabela 1: Użyte przeciwciała. Lista przeciwciał użytych w tym badaniu.

powiedział: powiedział:

przeciwciało	firma	odniesienie	źródło
Zobacz materiał 53BP1	Sygnalizacja komórkowa	Numer katalogowy: 4937	królik
Anty-mysie IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Księga Abcam	ab150103	osioł
Anty-fosfo-histon H2A. X (Ser139), klon JBW301	Milipory	Numer katalogowy: 05-636	mysz
Anty-królicze IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Księga Abcam	ab150081	koza

9. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy w PBS przez 1 minutę.
10. Szkiełka nakrywkowe myć_H2Oprzez 1 minutę.
11. Barwienie przeciwdziałające DNA za pomocą DAPI: nałożyć 10 μl 300 nM DAPI (zgodnie z opisem dla przeciwciał), inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zamontować na szkiełku podstawowym za pomocą podłoża montażowego na bazie glicerolu. Alternatywnie, dodaj jedną kroplę (10 μl) komercyjnego podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI na szkiełko podstawowe i nałóż szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe i usuń nadmiar płynu wokół niego ręcznikiem papierowym.
12. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut.
13. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Akwizycja obrazu

1. Umieść kroplę olejku immersyjnego na soczewce obiektywu 60x. Użyj DAPI, aby zlokalizować jądra przez okular.
   1. Aby uzyskać obraz XYZ, otwórz oprogramowanie do akwizycji i wybierz parametry: Typ skanera: Galvano; Tryb skanera: w obie strony; Rozmiar obrazu: 512×512; Tryb PMT: VBF; Średnia PMT: klatka (4 razy); Skanowanie sekwencyjne PMT: linia.
   2. Wybierz barwnik i detektory:
      Kanał (CH1), barwnik (DAPI), detektor (SD1)
      Kanał (CH2), Barwnik (Alexa Fluor 488), Detektor (HSD3)
      Kanał (CH3), Barwnik (Alexa Fluor 647), Detektor (HSD4)
   3. Wybierz ON w "Z".
2. Dostosuj obraz na żywo. Naciśnij przycisk Live (Na żywo) w oknie Live (Na żywo).
   1. Dostosuj ostrość i ustaw intensywność lasera (%), czułość (HV), wzmocnienie i przesunięcie w oknie narzędzi "PMT".
      1. Dostosuj intensywność lasera (%): dla jasności i wybielania. Im wyższa intensywność lasera, tym silniejszy sygnał, ale próbka będzie fotowybielać.
      2. Dostosuj czułość (HV): poziom hałasu. Im wyższa wartość HV, tym silniejszy sygnał, ale obraz będzie zaszumiony, jeśli będzie zbyt wysoki.
         UWAGA: Zawsze utrzymuj napięcie stałe.
      3. Dostosuj przesunięcie: poziom tła.
   2. Wybierz opcję Początek/Koniec (15 plasterków) dla stosów Z.
3. Rozpocznij nabywanie.
   1. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać obrazy. Naciśnij przycisk LSM Start, aby rozpocząć pobieranie obrazu. Naciśnij przycisk Seria Gotowe, aby zakończyć akwizycję obrazu.

Wyniki

Rysunek 1. Ekstrakcja jądrowa.

Reprezentatywne obrazy komórek przed (po lewej) i po (prawej) ekstrakcji nuklearnej. Cytoplazma powinna zostać strawiona, ale struktura jądrowa powinna pozostać nienaruszona po ekstrakcji (po prawej). (A) 20-krotne powiększenie; podziałka = 20 μm i (B) 40-krotne powiększenie; podziałka = 10 μm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełko nakrywkowe #1, 18 mm okrągłe (szkiełka nakrywkowe)	Choroba Neuvitro	NC0308920	Szkiełka nakrywkowe należy oczyścić i wysterylizować przed użyciem HCl lub etanolem.
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco (firma Gibco)	14190144	PBS do hodowli tkankowych
Uchwyt SlowFade Diamond Antifade z DAPI	Invitrogen	Numer katalogowy S36973	Zamiast tego można użyć DAPI 300 nM z nośnikiem montażowym VECTASHIELD Antifade.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Zalecana jest frakcja szoku cieplnego, aby uniknąć opadów/tła.
Tryton X-100	AmerykańskiBiografia	AB02025	Bufor do ekstrakcji jądrowej.
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus	Marka rybacka	1255015	Zamiast tego można użyć szkiełek polisynowych.