Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Streszczenie

Źródło: Kresoja-Rakic, J., et al. Oczyszczanie białek oddziałujących z RNA w komórkach międzybłoniaka za pośrednictwem powinowactwa do destiobiotyny i streptawidyny. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Protokół

1. Przygotowanie cytozolowej i jądrowej frakcji białkowej

1. Płytka 4 x 10⁶ komórek ACC-MESO-4 w kolbie do hodowli komórek T150 wyhodowanej w pożywce RPMI - 1640 uzupełnionej 10% FBS, 1x penicylina/streptomycyna (100x) i 2 mM L-Glutamina (200 mM). Gdy komórki osiągną zbieg 80-90% (~5-5,5 x 10⁶ komórek), przystąp do ekstrakcji białek frakcji jądrowych i cytozolowych.
   nuta: Linia komórkowa ACC-MESO-4 została uzyskana z RIKEN BioResource Centre.
2. Odessać pożywkę, przemyć komórki, dodając 15 ml 1x PBS, delikatnie przechylić płytkę kilka razy i odessać 1x PBS. Dodać 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować kolbę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 3 min.
   nuta: Spójrz na komórki pod mikroskopem pod kątem oderwania; Jeśli kolba jest nadal podłączona, stuknij kolbą w dłoń 3 razy.
3. Dodaj 7 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% FBS, 1x penicylina/streptomycyna (100x) i 2 mM L-glutaminy (200 mM), zbierz komórki w probówce o pojemności 15 ml i wiruj przy 200 x g przez 5 min.
4. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1,5 ml 1x PBS, a następnie przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować w temperaturze 500 x g i 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
   nuta: Począwszy od tego etapu, wszystkie etapy wirowania należy wykonywać w temperaturze 4 °C i utrzymywać wszystkie odczynniki na lodzie.
5. Zawiesić osad komórek w lodowatym 1,5 ml 1x PBS i wirować komórki w temperaturze 500 x g i 4 °C przez 3 minuty. Odrzucić supernatant.
   nuta: Wymagane ilości odczynników CER I, CER II i NER wynoszą odpowiednio 10, 0,55 i 5 objętości szacowanej objętości upakowanych osadów komórkowych; w poniższym protokole przyjmuje się objętość 20 μl. Zalecamy przygotowanie tylko wymaganej ilości odczynnika CER I.
6. Dodaj 200 μl lodowatego odczynnika do ekstrakcji cytoplazmatycznej (CER I) uzupełnionego 2 μl 1x inhibitora proteinazy, np. rozcieńczyć 1 tabletkę inhibitora proteazy (bez EDTA) w 500 μl wody, aby uzyskać 100x bulion. Taka ilość odczynnika CER I wystarcza do lizy 20 μl objętości wypełnionej granulkami komórek.
   1. Aby oszacować objętość wypełnionej granulki komórek, porównaj probówkę zawierającą osad komórkowy z probówką o pojemności 1,5 ml wypełnioną 10, 20, 50 lub 100 μl 1x PBS.
7. Ponownie zawiesić osad komórkowy, energicznie wirując probówkę przez 15 s i inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut. Dodać 11 μl lodowatego odczynnika do ekstrakcji cytoplazmatycznej II (CER II) do probówki, energicznie wirować przez 5 s i inkubować przez 1 minutę na lodzie.
8. Wirować energicznie przez 5 s i odwirować probówkę o temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Przenieść supernatant do czystej, wstępnie schłodzonej probówki na lodzie. Supernatant to frakcja cytoplazmatyczna, która jest dalej wykorzystywana w eksperymencie RNA-pulldown.
9. Zawiesić pozostały osad w 100 μl lodowatego odczynnika do ekstrakcji jądrowej (NER) uzupełnionego 1 μl inhibitora proteinazy (100x) i energicznie wirować przez 15 s. Zalecamy przygotowanie tylko wymaganej ilości odczynnika NER uzupełnionego inhibitorami proteazy.
10. Inkubować próbkę na lodzie przez 40 minut, od czasu do czasu wirując przez 15 s (co 10 minut).
11. Odwirować probówkę o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut. Przenieść supernatant (jest to frakcja białka jądrowego) do czystej, wstępnie schłodzonej probówki.
12. Natychmiast należy przystąpić do pomiaru stężenia białka metodą bicynkową (BCA) (patrz tabela materiałów). Aby kontrolować czystość białka każdej frakcji, należy przeprowadzić immunoblotting (ryc. 1) przeciwko α-tubulinie (dodatnie wykrycie tylko we frakcji cytozolowej) i polimerazie poliADP-rybozy - PARP (dodatnie wykrycie tylko we frakcji jądrowej).
13. Aby zachować aktywność białek i ich stan naturalny, przygotuj 25 μl podwielokrotności ekstraktów cytozolowych i jądrowych. Podwielokrotności należy zamrozić błyskawicznie, umieszczając je w ciekłym azocie na 5 s i przechowywać bezpośrednio w temperaturze -80 °C.

2. Znakowanie RNA za pomocą Desthiobiotin

1. Komercyjnie zsyntetyzować sondy RNA i oczyścić je metodą HPLC. Zawiesić wodą wolną od nukleaz w temperaturze 10 μM.
   nuta: Sekwencje sondy są wymienione w Tabeli 1.
2. Użyj 50 pmol RNA na reakcję RNA-pulldown. Rozmrozić i przechowywać wszystkie odczynniki na lodzie z wyjątkiem PEG 30%, używanego do oznaczania końca 3' oligonugolakukleotydu RNA.
3. Przenieść 5 μl 10 μM sond RNA, oznaczonych jako CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) i Unrelated-RNA (IRE), do cienkościennych probówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml i inkubować w maszynie do PCR w temperaturze 85 °C przez 5 minut. Natychmiast umieścić probówki na lodzie.
   nuta: Ten krok jest ważny, ponieważ sprzyja rozluźnieniu i dostępności sondy RNA do znakowania.
4. W przypadku pojedynczej reakcji o objętości 30 μl należy dodać do probówki zawierającej RNA następującą mieszaninę 10 μl: 3 μl wody wolnej od nukleaz, 3 μl 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA, 1 μl inhibitora RNazy (40 U/μL), 1 μl bisfosforanu cytydyny destiobiotynylowanej (1 mM) i 2 μl ligazy RNA T4 (20 U/μL).
   nuta: Aby przygotować główną mieszankę A dla 3 próbek w nadmiarze (3.2), zmieszaj 9,6 μl wody wolnej od nukleaz, 9,6 μl 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA, 3,2 μl inhibitora RNazy (40 U/μL), 3,2 μl destiobiotynylowanego bisfosforanu cytydyny (1 mM) i 6,4 μl ligazy T4 RNA (20 U/μL).
5. Dodać ostrożnie 15 μL PEG 30% do reakcji. Użyj innej wskazówki, aby wymieszać reakcję. Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C.
6. Następnego dnia przygotuj następujące preparaty: 5 M NaCl (świeży/bez nukleazy), chloroform: alkohol izoamylowy w proporcji 24:1 (np. na reakcję - 96 μl chloroformu i 4 μl alkoholu izoamylowego), lodowaty 100% etanolu i lodowaty 70% etanolu.
7. Dodać 70 μl wody wolnej od nukleaz do probówek reakcyjnych znakujących RNA. Dodać 100 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego i krótko odwirować. Odkręcanie przy 13 000 x g przez 3 min. Ostrożnie wyjmij TYLKO górną fazę i przenieś do nowej probówki 1,5 ml wolnej od nukleaz; Unikaj dotykania dolnej fazy.
8. Dodaj 10 μl 5 M NaCl, 1 μl glikogenu i 300 μl lodowatego 100% etanolu. Umieść probówkę w temperaturze -20 °C na 2 godziny < br /> nuta: Na tym etapie eksperyment można kontynuować następnego dnia.
9. Wirować przy 13 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 min. Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Dodać 300 μl lodowatego 70% etanolu i ponownie odwirować w temperaturze 13 000 x g i 4 °C przez 5 minut.
10. Całkowicie odrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu (15 min). Zawiesić osad w 20 μl wody wolnej od nukleaz.
    nuta: Kontynuuj ściąganie RNA tego samego dnia.
11. Inkubować RNA w temperaturze 90 °C przez 2 minuty i umieścić go na lodzie. Umieść oznakowany RNA na lodzie podczas następnego etapu wstępnego mycia kulek magnetycznych streptawidyny.
    nuta: Dłuższy czas inkubacji może uszkodzić sondę RNA.

3. Ściąganie białka RNA

1. Wstępne mycie kulek magnetycznych streptawidyny i inkubacja z destiobiotyną-RNA
   1. Użyj 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny na 50 pmol RNA. Należy to jednak zoptymalizować w zależności od eksperymentu.
   2. Wirować probówkę z kulkami magnetycznymi streptawidyny przez 15 s i szybko usunąć 200 μl (mieszanka główna; wystarczająca na 3+1 reakcji) do czystej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą przeciętych końcówek do pipet. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym tak, aby koraliki zebrały się z boku rurki i odczekaj 1 minutę. Usunąć płyn do sporządzania zawiesiny.
   3. Aby umyć kulki, wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 400 μl 0,1 M roztworu NaOH i 0,05 M NaCl i delikatnie pipetuj kilka razy w górę iw dół. Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym. Odczekać 1 minutę i zebrać supernatant. Powtórz ten krok ponownie.
   4. Umyj kulki 200 μl 100 mM NaCl. Usunąć supernatant.
   5. Dodać 200 μl 20 mM Tris (pH 7,5), ponownie zawiesić kulki przez pipetowanie, umieścić probówkę na stojaku magnetycznym, odczekać 1 minutę i usunąć supernatant. Powtórz ten krok.
   6. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 200 μl bufora do wychwytywania RNA i ponownie zawieś kulki magnetyczne streptawidyny przez krótkie wirowanie. Usuń 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny i dodaj do każdej znakowanej probówki RNA za pomocą przeciętej końcówki pipety. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wałku.
2. Wiązanie białka z RNA
   1. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i usuń supernatant.
   2. Dodać 50 μl 20 mM Tris (pH 7,5) do kulek i ponownie zawiesić przez pipetowanie. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i usuń supernatant. Powtórz ten krok.
   3. Dodać 100 μl 1x buforu wiążącego białko-RNA do kulek i ponownie zawiesić przez pipetowanie.
   4. W międzyczasie przygotuj następującą mieszankę: 10 μL 10x buforu wiążącego białko-RNA, 30 μL 50% glicerolu, 50 μg białek cytoplazmatycznych i woda wolna od nukleaz do 100 μL.
      nuta: Przygotować główną mieszankę B dla 3 próbek w nadmiarze (3.3) w następujący sposób: 33 μl 10x bufor wiążący białko-RNA, 99 μl 50% glicerolu, 165 μg białek cytoplazmatycznych i woda wolna od nukleaz do 330 μl. Probówkę z mieszanką główną B należy przechowywać na lodzie.
   5. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i zbierz supernatant. Dodać 100 μl mieszanki wzorcowej B, zawiesić ponownie, delikatnie pipetując w górę i w dół, unikając tworzenia się pęcherzyków. Inkubować probówki reakcyjne przez 60 minut w temperaturze 4 °C na walcu.
3. Przemywanie i elucja
   1. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, zbierz supernatant (który przepływa - FT) i przenieś go do nowej probówki.
      nuta: Zachowaj ten FT na lodzie do późniejszej analizy.
   2. Odpipetować 100 μl 1x buforu do płukania na kulkach, delikatnie zawiesić, włożyć z powrotem do stojaka magnetycznego, odczekać 1 minutę i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok 2 razy.
   3. Dodać 40 μl buforu elucyjnego do kulek magnetycznych, mieszać pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce probówkowej (950 obr./min) przez 30 min.
   4. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i zbierz eluowaną próbkę (która jest eluatem - E). Umieścić na lodzie i użyć do dalszej analizy.
      nuta: Na tym etapie każda badana sonda RNA składa się z próbki przepływowej (FT) i eluatu (E).

Wyniki

Rycina 1: Analiza Western blot 5 μg cytozolowej i jądrowej frakcji białkowej. Białko PARP jest obecne we frakcji jądrowej (N), ale nieobecne we frakcji cytozolowej (C). α-tubulina jest obecna we frakcji cytozolowej (C), ale nieobecna we frakcji jądrowej (N).

Tabela 1: Sekwencje sond RNA

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NE-PER Zestaw do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznej	Thermo Fisher Naukowy	Numer telefonu 78833
Tabletki inhibitora proteazy Pierce, wolne od EDTA	Thermo Fisher Naukowy	Numer telefonu A32965
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 23225
Pierce Magnetyczny zestaw do ściągania białka RNA	Thermo Fisher Naukowy	Rok 20164	Zawiera kulki magnetyczne, dlatego zestaw należy przechowywać w temperaturze 4 °C
Zestaw do destiobiotynylacji końca Pierce RNA 3'	Thermo Fisher Naukowy	Rok 20163	Zestaw jest częścią zestawu "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" i musi być przechowywany w temperaturze -20 °C, w przeciwieństwie do zestawu pull-down (4 °C).
DynaMag-2, podstawka magnetyczna	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy 12321D
RPMI - 1640 średni	Sigma-Aldrich	Czynnik R8758
FBS - Filtrowana surowica bydlęca	Pan Biotechnologia	Zobacz materiał P40-37500
Penicylina - streptomycyna (100x)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4333
Roztwór L-glutaminy (200 mM)	Sigma-Aldrich	Klasa G7513
0,25% Trypsyna-EDTA (1x)	Technologie Gibco by Life	Numer katalogowy: 25200-056
Roztwór do odkażania RNazaz RNaseZap	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał AM9780
Synteza oligonuligoligów RNA	Mycrosynth AG, Szwajcaria	-	Skala syntezy - 0,04 μmol - oczyszczona metodą HPLC
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A7030
Kwas solny (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	Numer katalogowy 182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7,5	Thermo Fisher Naukowy	15567027
glicerol	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 17904	50% sterylnych podwielokrotności do przechowywania w temperaturze -20°C
Koraliki magnetyczne Pierce Streptavidin	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 88817	Należy pamiętać, że te kulki magnetyczne mają średnią średnicę 1 μm (zakres od 0,5 do 1,5 μm). Ponadto Streptawidyna Dynabeads-M280, która jest kulkami o jednorodnej wielkości 2,8 μm, jest również stosowana w RNA-pulldown, ale należy pamiętać, że może to wpływać na proces oczyszczania.
Hydrat siarczanu glinu (14-18)	Sigma-Aldrich	368458
Kwas ortofosforowy	Aplikacja	Nr kat. A0637