$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Reakcja wiązania białek i separacja związanego RNA
- Przeprowadzić wiązanie białka i RNA w 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 w objętości 100 μL, dodając następujące składniki do tych końcowych stężeń: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 μg/μL albuminy surowicy bydlęcej, 0,5 jednostki/μL RNasin, 0,15 μg/μL tRNA, 1 mM EDTA, i 30 μL o odpowiednim stężeniu białka rekombinowanego (PTB). Dodaj RNA z odpowiedniej puli.
nuta: Czynnik splicingowy U2AF65 zazwyczaj wiąże się z miejscami splicingu traktu polipirymidynowego / 3' modelowych intronów o powinowactwie wiązania (równowagowa stała dysocjacji lub Kd) około 1–10 nM. Dlatego w pierwszych dwóch rundach wiązania stosowano stężenie białka 10-krotnie wyższe niż Kd dla U2AF65; dla białek SXL i PTB początkowe stężenie w tym zakresie było tylko naszym najlepszym przypuszczeniem. Zapewniło to, że pożądane gatunki RNA mogą się wiązać, chociaż sekwencje o niższym powinowactwie również były potencjalnie związane. W rundach 3 i 4 (transkrypcja, wiązanie i amplifikacja) stężenie białka zmniejszyło się trzykrotnie. Miało to na celu skuteczne wyeliminowanie gatunków RNA o niskim powinowactwie.
- Umieścić probówki zawierające reakcje wiązania na około 30 minut w temperaturze 25 °C w bloku temperatury (lub na lodzie).
- Frakcjonuj związany RNA od niezwiązanego RNA przez pierwsze 4 rundy selekcji-amplifikacji, wykonując następujące kroki.
- Przefiltrować próbkę (100 μl) w temperaturze pokojowej przez filtr nitrocelulozowy podłączony do kolektora próżniowego.
nuta: Kompleks RNA-białko, ale nie niezwiązany RNA, pozostaje na filtrze.
- Posiekaj filtr z zatrzymanym RNA na fragmenty za pomocą sterylnej żyletki; włóż je do probówki wirówkowej. Odzyskać RNA poprzez delikatne bębnowanie probówki przez co najmniej 3 godziny (lub noc) z kawałkami filtra zanurzonymi w buforze proteinazy K (PK).
- Odbiałczić próbkę RNA poprzez wirowanie jej w obecności równej objętości chloroformu fenolowego (1:1), a następnie chloroformu. Za każdym razem odzyskuje się fazę wodną, odwirowując próbkę z dużą prędkością przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Wymieszać go z octanem sodu (0,1 objętości 3,0 M, pH 5,2) i etanolem (2-3 objętości absolutnego etanolu, 200 proof). Pozostawić probówkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 30 minut, odwirować ją na wysokich obrotach przez 10 minut, a następnie, postępując zgodnie z etapem mycia i suszenia, rozpuścić RNA w wodzie uzdatnionej DEPC.
- Oddziel frakcje RNA związane z białkiem od frakcji niezwiązanych przez ostatnie 2 rundy (rundy 5 i 6; transkrypcja, wiązanie i amplifikacja) w następujący sposób. Zmniejszyć stężenie białka w reakcji wiązania (krok 1.1) o dalsze trzykrotne zwiększenie ciśnienia selekcyjnego w celu wzbogacenia sekwencji wiążących o wysokim powinowactwie i preferencyjnego usunięcia sekwencji o niskim powinowactwie.
- Wstępnie wylać natywny żel poliakryloamidowy (5% o stosunku 60:1 akryloamid do bis-akryloamidu) w 0,5x buforze TBE (Tris-Borate-EDTA) przed rozpoczęciem powyższej reakcji wiązania RNA: białko (krok 1.1). Elektroforezę tego żelu w chłodni (4 °C) stosując 250 V przez 15 min.
- Odpipetować powyższe reakcje wiązania RNA:białko (krok 1.1) do różnych studzienek tego żelu.
nuta: Białko jest przechowywane w temperaturze -80 °C i rozcieńczane przed użyciem w 20 mM kwasie 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowym (HEPES), pH 8,0, 20% glicerolu, 0,2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,05% NP-40 i 1 mM ditiotreitolu (DTT). Dodanie 0,5–1,0 mM inhibitora proteazy fluorku fenylometanu sulfonylu (PMSF) jest opcjonalne. W reakcji wiązania bufor ten wnosi około 6% glicerolu, co pozwala na bezpośrednie ładowanie próbek do studzienek bez konieczności mieszania ich z oddzielnym buforem ładującym żel.
- Frakcjonować związany RNA od niezwiązanego RNA za pomocą elektroforezy żelowej w chłodnym pomieszczeniu (4 °C) pod napięciem 250 V przez 1 do 2 godzin. Proces ten jest również znany jako test przesunięcia ruchliwości żelu.
UWAGA: Czas trwania elektroforezy różni się w zależności od cech RNA i białka użytego do wiązania.
- Wystaw żel na kliszę rentgenowską i zidentyfikuj lokalizację związanego RNA za pomocą autoradiografii. Wytnij plasterek żelu ze związanym RNA i włóż go do probówki.
- Inkubować rozdrobniony plasterek żelu w buforze PK używanym do elucji przez 3 godziny lub przez noc.
- Energicznie wyluzowaną próbkę RNA należy energicznie wymieszać, najpierw chloroformem fenolowym, a następnie chloroformem.
- Zmieszać octan sodu i etanol z fazą wodną po ekstrakcji chloroformem. Po inkubacji w zamrażarce o temperaturze -80 °C wirować w temperaturze 4 °C przez 5–10 minut, aby zebrać osad RNA. Umyj osad RNA etanolem i wysusz go na powietrzu, pozostawiając otwartą pokrywę probówki. Rozpuść RNA w wodzie uzdatnionej DEPC.
nuta: Przejście na test przesunięcia ruchliwości żelu do frakcjonowania pozwala na eliminację niepożądanych gatunków RNA, które mogły zostać wzbogacone w celu związania się, na przykład, z filtrem nitrocelulozowym (lub dowolną matrycą) używaną w początkowych rundach do frakcjonowania.
2. Odwrotna transkrypcja i amplifikacja PCR
- Zsyntetyzować cDNA z rozpuszczonego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy i odwrotnego startera przez inkubację 20 μl reakcji (2 μl 10x buforu RT, 2 μl odwrotnej transkryptazy AMV, 1 μM odwrotnego starterazy, 10 μL RNA, opcjonalnie inhibitor RNazy) w temperaturze 42 °C przez 60 min.
- Amplifikuj cDNA za pomocą 20-25 cykli PCR. Dołączyć promotor polimerazy RNA T7 do biblioteki za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zawierającej 1 μM matrycę biblioteki losowej DNA, 1 μM każdego startera, 20 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1 μg/μL acetylowanej albuminy surowicy bydlęcej, 2 jednostki polimerazy Taq i po 200 μM dNTP (deoksyguanozyna, deoksyadenozyna, deoksycytydyna i trifosforan deoksytymidyny).
3. Transkrypcja i wiązanie białek
- Powtórz proces syntezy RNA, wiązania białek i oddzielania frakcji związanych z białkiem i niezwiązanych.