Termoforeza w mikroskali do badania interakcji białko-lipid w roztworze

Streszczenie

Źródło: Sparks, R. P. et al., Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid.J. Vis. Exp.(2022)

Ten film demonstruje termoforezę w mikroskali do badania interakcji białko-lipid. Test wykrywa interakcję między cząsteczkami poprzez ilościowe określenie ruchu termoforetycznego białek znakowanych fluorescencyjnie w odpowiedzi na gradient temperatury. Cząsteczka fluorescencyjna jest mieszana z różnymi stężeniami niefluorescencyjnych cząsteczek lipidów, a mieszanina cząsteczek w roztworze jest ładowana do naczyń włosowatych. Do próbek w kapilarach stosuje się gradient temperatury, a ruch cząsteczki fluorescencyjnej w gradiencie temperatury jest wykrywany i rejestrowany.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów

1. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH₂PO₄ i 2 mM KH₂PO_4, pH 7,4.
2. Przygotować barwnik NTA-Atto 647 N. Rozcieńczyć podstawowy barwnik NTA-Atto 647 N do 100 nM ze 100% roztworu DMSO do PBS bez Tween.
3. Ekspresja Vam7-His8 – Białko jako białko fuzyjne w E. coli i oczyść je za pomocą Ni-NTA i chromatografii wykluczania wielkości.
4. Miareczkować analit w buforze PBS. Jeśli analit znajduje się w innym buforze, znakowany MST nie jest szczególnie wrażliwy na niewielkie różnice w buforze od cząsteczek takich jak DMSO, chyba że zawartość buforu analitu wchodzi w interakcję z znakowanym białkiem.

2. Przygotowanie urządzenia MST

1. Włącz wyłącznik zasilania z tyłu urządzenia.
2. Otwórz oprogramowanie sterujące i upewnij się, że laptop jest włączony i ma stan połączenia na komputerze podłączonym do urządzenia.
3. Wprowadź ustawienia fluorescencji i MST dla tego eksperymentu. Ustaw MST Before na 3 s, MST na 30 s i Odzysk fluorescencji (Fluo.)po 1 s. Przed pomiarem wstępnej fluorescencji i nie wymaga długich czasów; MST to rzeczywista ilość czasu, w którym należy osiągnąć równowagę po indukcji ciepła.
4. Tabela kapilarn: Dla każdej rurki kapilarnej wprowadź nazwę celu (liganda), nazwę liganda (analitu), stężenie celu i najwyższe stężenie miareczkowania i użyj współczynnika miareczkowania autouzupełniania. Na przykład wprowadź 50 nM dla docelowego stężenia Vam7-His8, Vam7-His8 jako nazwę docelową, (kwas 1,2-dioktanoilofosfatydowy) Di-C8 PA jako nazwę liganda i najwyższe stężenie liganda, wybierając 1:1 i przeciągając w dół do miejsc autouzupełniania 2-16.
5. Uruchom skanowanie nasadki, aby wybrać odpowiednią diodę LED (20% diody LED (ustawienie wstępne)) w oparciu o sygnał białka docelowego i dostosuj od 200 do 2000 jednostek fluorescencji dla znakowanego MST. Skany czapek powinny pokazywać jednolite zaokrąglone szczyty w kształcie dzwonu.
6. Wybierz zakres mocy MST i wprowadź wartości dla każdej z nich, aby przetestować najbardziej solidne dopasowanie wiązania, a następnie naciśnij Start Cap Scan + Measurement, skanując różne wartości w celu określenia najlepszych warunków pracy dla danej testowanej interakcji.
7. Określ moc MST z najlepszym dopasowaniem, korzystając z oprogramowania analitycznego i ustawienia wstępnego dla termoforezy za pomocą Tjump. Analizuj pasowania zgodnie z większością separacji fluorescencji między najniższym i najwyższym stężeniem w porównaniu z mocą MST z najlepszym dopasowaniem i wybierz moc MST do prób powtórzonych.
8. Określ, czy między pierwszym a drugim uruchomieniem wystąpiło fotowybielanie, przechodząc do oprogramowania do analizy i przełączając analizę w tryb ekspercki. Następnie do analizy wybierz fluorescencję zamiast termoforezy. Wybierz tryb eksperta, a następnie fotowybielanie.

3. Przygotowanie próbek do oznakowania MST

1. Doprowadzić roztwór Vam7-His8 do stężenia 200 nM w PBS bez Tween.
2. Doprowadź barwnik NTA-Atto 647 do 100 nM w PBS bez Tween.
3. Wymieszać barwnik Vam7-His8 i NTA-Atto 647 w stosunku objętościowym 1:1 i pozostawić w temperaturze pokojowej pod przykryciem światła przez 30 minut. Określić odpowiednie stężenie białka docelowego, jak w sekcji 2.5 (patrz Suplement dotyczący wykorzystania barwnika KD Ni-NTA, jak pokazano na filmie).
4. Odwirowywać mieszaninę barwnika NTA-Atto 647 N i białka przez 10 minut w ciemnym pomieszczeniu przy użyciu wirówki stołowej o sile około 8,161 g.
5. Przechowywać mieszaninę w temperaturze 4 °C po doświadczeniu lub na lodzie w trakcie eksperymentu w celu ponownego użycia w ciągu kilku godzin, jeśli jest to konieczne, aby zapobiec denaturacji białka.
6. Użyj wyszukiwarki stężeń NT, aby określić zakres stężeń potrzebny do miareczkowania.
7. Doprowadzić Di-C8 PA do odpowiedniego maksymalnego stężenia w wodzie.
8. Miareczkować analit, stosując seryjne rozcieńczanie w stosunku 1:1 w buforze PBS dla 16 stężeń w oparciu o poprzedni krok. W przeciwieństwie do SPR, termoforeza nie jest tak wrażliwa na różnice.

4. MST próbek

1. Włącz urządzenie i podłączony laptop.
2. Naciśnij strzałkę w górę z przodu urządzenia i wysuń stojak kapilarny.
3. Załaduj kapilary do stojaka o najwyższym stężeniu w pozycji 1.
4. W oprogramowaniu sterującym wybierz czerwony kanał odpowiadający NTA-Atto 647 N.
5. Wprowadź informacje o stężeniu, położeniu i nazwie dla każdej kapilary w tabeli naczyń włosowatych.
6. Uruchom skanowanie kapilarne, naciskając Start Cap Scan przy 20% diodzie LED (ustawienie wstępne) i odpowiednio dostosuj od 200 do 2000 jednostek fluorescencji, używając ustawień intensywności diody LED lub stężenia liganda (znakowanego białka).
7. Wybierz zakres mocy MST.
8. Rozpocznij skanowanie nasadki + pomiar MST.
9. Analizuj za pomocą oprogramowania analitycznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cy5 Monoreaktywny barwnik maleimidowy	GE Opieka zdrowotna	PA23031	Do znakowania białek
Pryzmat GraphPad	Oprogramowanie GraphPad
Kapilary Monolith NT.115 (1000 sztuk)	Nanotemper	MO-K022	Kapilary do MST
Maszyna Monolith NT.115	Nanotemper		Wyposażenie uczelni
NTA-ATTO 647 N	Sigma	2175	Etykieta dla Jego tagów
3-fosforan fosfatydyloinozytolu diC8 (PI(3)P diC8)	eszelon	Zobacz materiał P-3008	Lipidy do eksperymentów wiążących

szt.