Termoforeza w mikroskali do badania interakcji białko-lipid w roztworze

Streszczenie

Źródło: Sparks, R. P. et al., Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid.J. Vis. Exp.(2022)

Ten film demonstruje termoforezę w mikroskali do badania interakcji białko-lipid. Test wykrywa interakcję między cząsteczkami poprzez ilościowe określenie ruchu termoforetycznego białek znakowanych fluorescencyjnie w odpowiedzi na gradient temperatury. Cząsteczka fluorescencyjna jest mieszana z różnymi stężeniami niefluorescencyjnych cząsteczek lipidów, a mieszanina cząsteczek w roztworze jest ładowana do naczyń włosowatych. Do próbek w kapilarach stosuje się gradient temperatury, a ruch cząsteczki fluorescencyjnej w gradiencie temperatury jest wykrywany i rejestrowany.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów

1. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH₂PO₄ i 2 mM KH₂PO_4, pH 7,4.
2. Przygotować barwnik NTA-Atto 647 N. Rozcieńczyć podstawowy barwnik NTA-Atto 647 N do 100 nM ze 100% roztworu DMSO do PBS bez Tween.
3. Ekspresja Vam7-His8 – Białko jako białko fuzyjne w E. coli i oczyść je za pomocą Ni-NTA i chromatografii wykluczania wielkości.
4. Miareczkować analit w buforze PBS. Jeśli analit znajduje się w innym buforze, znakowany MST nie jest szczególnie wrażliwy na niewielkie różnice w buforze ....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cy5 Monoreaktywny barwnik maleimidowy	GE Opieka zdrowotna	PA23031	Do znakowania białek
Pryzmat GraphPad	Oprogramowanie GraphPad
Kapilary Monolith NT.115 (1000 sztuk)	Nanotemper	MO-K022	Kapilary do MST
Maszyna Monolith NT.115	Nanotemper		Wyposażenie uczelni
NTA-ATTO 647 N	Sigma	2175	Etykieta dla Jego tagów
3-fosforan fosfatydyloinozytolu diC8 (PI(3)P diC8)	eszelon	Zobacz materiał P-3008	Lipidy do eksperymentów wiążących

szt.