Ilościowa cytometria przepływowa do badania znakowanych interakcji pęcherzyków białko-fosfolipid

Streszczenie

Źródło: Podoplelova, N. et al., Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi za pomocą ilościowej cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2022)

W tym filmie pokazujemy interakcję między białkami a sztucznymi pęcherzykami fosfolipidowymi za pomocą ilościowej cytometrii przepływowej. Wiązanie białek znakowanych fluorescencyjnie z pęcherzykami fosfolipidowymi znakowanymi fluorescencyjnie zwiększa średnią intensywność fluorescencji, a wzrost ten jest wykrywany przez cytometr przepływowy.

Protokół

1. Wykrywanie interakcji białko-lipid za pomocą cytometrii przepływowej

1. Eksperymenty z wiązaniami kinetycznymi
   1. Rozcieńczyć pęcherzyki fosfolipidowe w buforze Tyrode'a (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glukozy, 0,5% BSA, pH 7,4) do stężenia 1 μM i całkowitej objętości 250 μL.
   2. Zmieszać znakowany fluorescencyjnie czynnik krzepnięcia X (fX-fd) z etapu 1 w stężeniu 500 nM z pęcherzykami fosfolipidowymi z kroku 1.1.1 w stosunku 1:1 (końcowe stężenie pęcherzyków 0,5 μM, stężenie fX-fd wynosi 250 nM fX) do całkowitej objętości 500 μl.
   3. Natychmiast wstrzyknąć 500 μl zmieszanej zawiesiny (~20 min w przypadku analizy przy niskim natężeniu przepływu) do cytometru przepływowego. Stosować niskie natężenie przepływu i upewnić się, że próg dla kanału FL2 (wzbudzenie 488 nm, filtr emisyjny 585/42 nm) wynosi wartość 200. Zmierzyć średnią fluorescencję w kanale FL4 (wzbudzenie 633 nm, filtr emisyjny 660/20) dla barwnika fluorescencyjnego z Tabeli Materiałów.
      nuta: Wybierz cytometr bez automatycznego podajnika próbek. Przyspieszy to proces wstrzykiwania próbki do celi pomiarowej.
   4. Po osiągnięciu nasycenia wiązania (brak znaczącego wzrostu fluorescencji w ciągu 5 minut), szybko rozcieńczyć próbkę 20-krotnie buforem Tyrode'a i monitorować dysocjację aż do osiągnięcia podstawowej fluorescencji (całkowita dysocjacja) lub do osiągnięcia plateau (brak znaczącego spadku fluorescencji w ciągu 5 minut).
      nuta: Jako kontrolę dodaj 10 μM EDTA i monitoruj całkowitą dysocjację przez 5 minut.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester sukcynimidylu)	Thermo Fisher Naukowy	Numer telefonu A37573	Barwnik fluorescencyjny
BD FACSCantoII	BD Bioscience
DiIC16(3) (nadchloran 1,1'-diheksadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny)	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał D384	Barwnik fluorescencyjny
Dmso	Sigma Aldrich	Zobacz materiał D8418
HEPESY	Sigma Aldrich	H4034-500G
L-α-fosfatydyloseryna (mózg, świnia) (sól sodowa)	Lipidy polarne Avanti	840032P
L-α-fosfatydylocholina (mózg, świnia)	Lipidy polarne Avanti	840053P
Mini-ekstruder	Lipidy polarne Avanti	610020-1EA
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P9541-500G
Chlorek wapnia, bezwodny, w proszku, ≥97%	Sigma Aldrich	Zobacz materiał C4901-100G
Sodu fosforan jednozasadowy	Sigma Aldrich	S3139-250G
chlorek sodu	Sigma Aldrich	S3014-500G
Chlorek magnezu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał M8266-100G
Albumina surowicy bydlęcej	VWR Nauki przyrodnicze AMRESCO	AM-O332-0.1
Sól disodowa EDTA	VWR Nauki przyrodnicze AMRESCO	AM-O105B-0.1