UWAGA: powinny być filtrowane za pomocą filtra 0,22 μm i odgazowywane przez próżnię przez 1 godzinę.
1. Preparat pęcherzyków lipidowych
- Użyj szklanych probówek o pojemności 2 ml. Rozpuścić każdy lipid, 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DOPC), 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (POPC), 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-serynę (POPS) i cholesterol (Chol) w mieszaninie chloroformu/metanolu (50:50 v/v) w celu przygotowania klarownego roztworu lipidowego o stężeniu 5 mM. Rozpuścić 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inozytol-4',5'-bisfosforan) (PI(4,5)P2) w mieszaninie chloroformu/metanolu/wody (20:9:1 v/v).
- Połącz rozpuszczone lipidy w pożądanym stosunku molowym POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20) i POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (Tabela 1) w szklanych probówkach o pojemności 10 ml.
nuta: Ostateczna ilość lipidów ogółem wynosi 500 μg.
- Odparować rozpuszczalniki organiczne za pomocą suchego strumienia azotu. Pozostawić mieszaninę lipidów w systemie wysokopróżniowym (liofilizacji) na 3 godziny w celu usunięcia wszelkich pozostałości śladów rozpuszczalników.
nuta: W ten sposób uzyskuje się suchą, przezroczystą powłokę.
- Zawiesić film lipidowy w 1 ml buforu cytrynianowego (10 mM cytrynianu trisodu, 150 mM NaCl, pH 4,6). Zawiesinę lipidową inkubować w temperaturze 60 °C (temperatura ta jest o około 10 °C wyższa od temperatury przemiany fazowej najwyżej topniejącego lipidu w mieszaninie) przez 30 minut w łaźni wodnej i energicznie wirować co 5 minut
nuta: Powoduje to powstawanie dużych, wielopłytkowych pęcherzyków (MLV). Utrzymać zawiesinę powyżej temperatury przejścia.
- Rozgrzej wytłaczarkę (w tym przypadku w temperaturze 60 °C) wyposażoną w membranę poliwęglanową o średnicy porów o średnicy 50 nm powyżej temperatury przejścia (która w tym przypadku wynosi 40 - 50 °C) przez 30 minut.
- Załaduj zawiesinę MLV do podgrzanej wytłaczarki i delikatnie przepuść mieszaninę 31x przez membranę poliwęglanową, aby utworzyć małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV). Utrzymuj temperaturę powyżej temperatury przejścia.
- Przenieść zawiesinę SUV do plastikowego naczynia reakcyjnego o pojemności 2 ml i dodać bufor cytrynianu (patrz krok 1.4), aby doprowadzić końcową objętość do 2 ml.
nuta: W ten sposób uzyska się końcowe stężenie lipidów na poziomie 250 μg/ml.
2. Obsługa czujników kwarcowych
UWAGA: Zawsze obsługuj czujniki kwarcowe za pomocą pęsety.
- Inkubować cztery czujniki umieszczone w uchwycie z politetrafluoroetylenu w 2% roztworze SDS przez ≥ 30 minut. Umyj je dokładnie ultraczystą wodą, aby całkowicie usunąć SDS i pozwól im wyschnąć przy użyciu strumienia suchego argonu lub azotu.
- Użyj systemu czyszczenia plazmowego, aby całkowicie usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Włóż suche czujniki do komory czyszczenia plazmowego, opróżnij komorę i przepłucz ją 3x tlenem. Włącz odkurzacz plazmowy. Użyj następujących parametrów procesu: ciśnienie 1 x 10-4 Torr, wysoka częstotliwość radiowa (RF) i 10 minut czasu procesu. Wyłącz maszynę i wyjmij czujniki.
3. Obsługa mikrowagi
UWAGA: Zastosowano system mikrowagi z czterema komorami przepływowymi o kontrolowanej temperaturze w konfiguracji równoległej, podłączonymi do pompy perystaltycznej i ustawionymi na natężenie przepływu 80 μL/min. W trybie przepływu otwartego bufor był pompowany ze zbiornika zasilającego do zbiornika odbiorczego. W trybie pętli zbiornik odbiorczy został podłączony do zbiornika zasilającego w celu wygenerowania pętli zamkniętej. Temperaturę ustawiono na 20 °C.
- Ostrożnie zanurz oczyszczone plazmowo czujniki w 4 komorach przepływowych za pomocą pęsety. Unikaj nacisku lub skręcania komór i rurek, które mogą powodować wycieki.
- Przepłukać układ buforem cytrynianowym (10 mM cytrynian trisodu, 150 mM NaCl, pH 4,6) w trybie otwartego przepływu przez 10 min.
nuta: Wymaga to dokładnie 3,2 ml buforu, ale zaleca się użycie nadmiaru buforu (10 ml).
- Uruchom program. Rozpocznij rejestrowanie wszelkich zmian częstotliwości i rozproszenia pierwszego tonu podstawowego (n = 1.) i alikwotów (n = 3 - 13) za pomocą oprogramowania, aż linie bazowe częstotliwości i rozpraszania ustabilizują się (zajmie to około 40 - 60 minut).
nuta: Poziomy szumów o częstotliwości (międzyszczytowe) powinny być niższe niż 0,5 Hz, a dla rozpraszania niższe niż 0,1·10-6, przy maksymalnym dryfcie (w roztworze wodnym) wynoszącym 1 Hz/h w częstotliwości i 0,3·10-6/h w rozpraszaniu.
- Gdy linie podstawowe są stabilne, nanieść zawiesinę SUV w buforze cytrynianowym (2 ml w małej tubce). Za pomocą naczynia reakcyjnego usunąć 1,5 ml martwej objętości. Następnie zamknij system w trybie przepływu pętlowego. Rejestruj zmianę częstotliwości/rozpraszania przez kolejne 10 minut.
nuta: W tym czasie pęcherzyki rozprzestrzenią się na powierzchnię SiO2 i połączą się, tworząc ciągłą dwuwarstwę (krok 2 na rysunkach 1, rysunku 2 i rysunku 3). Adsorpcja SUV-ów na powierzchni czujnika jest dwufazowa i ma typową minimalną i maksymalną częstotliwość rozpraszania. Stabilna nowa linia bazowa częstotliwości/rozpraszania z charakterystycznym przesunięciem częstotliwości (w zależności od składu lipidowego) w zakresie 26 - 29 Hz (patrz tabela 1) wskazuje na ciągłą dwuwarstwę na powierzchni.
- Gdy SLB jest stabilny (patrz krok 3.4), zrównoważyć układ z pracującym buforem (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) przy wymaganych stężeniach Ca2+ (w zakresie od 50 μM do 1 mM CaCl2, w zależności od doświadczenia) w trybie otwartego przepływu przez 40 minut.
- Dodaj białko (tutaj AnxA2) do uruchomionego buforu zawierającego Ca2+ (patrz krok 3.5). Aplikację białka należy wykonywać w trybie przepływu pętlowego, aż do osiągnięcia stanu równowagi (krok 3 na rysunku 1, rysunku 2 i rysunku 3).
nuta: Stężenie białka może wynosić od 1 do 400 nM. Adsorpcja białek powoduje zależne od stężenia przesunięcie częstotliwości odzwierciedlające adsorpcję masy (białka).
- Dysocjacja związanego białka przez chelatację jonów Ca2+ z 5 mM EGTA w buforze roboczym w trybie otwartego przepływu (krok 4 na rysunkach 1 i rysunku 2).
nuta: Powrót częstości i dyspersji do wartości wyjściowej SLB wskazuje na całkowitą odwracalność wiązania z białkami. Cykle asocjacji-dysocjacji można powtarzać w celu porównania różnych stężeń lub białek.
