$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Obrazowanie powstawania kondensacji EWS-FLI1 na zasłonach DNA
- Otwórz oprogramowanie do obrazowania, znajdź i zaznacz pozycje 3 × 3 zygzakowatych wzorów pod jasnym polem.
- Włącz przepływ przy 0,2 ml/min, aby wybarwić DNA dwuniciowym barwnikiem DNA przez 10 minut.
- Rozcieńczyć mCherry-EWS-FLI1 buforem obrazującym do stężenia 100 nM w 100 μl w probówce.
- Załadować próbkę białka przez zawór za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 100 μl i zmienić natężenie przepływu na 0,4 ml/min.
- Włącz laser o długości fali 488 nm i wstępnie zeskanuj każdy region, aby sprawdzić stan dystrybucji DNA; wybierz region, w którym cząsteczki DNA rozprowadzają się równomiernie. Ustaw moc lasera na 10% dla lasera 488 nm i 20% dla lasera 561 nm. Użyj miernika mocy, aby zmierzyć rzeczywistą moc lasera w pobliżu pryzmatu: 4.5 mW dla lasera 488 nm i 16.0 mW dla lasera 561 nm.
- Akwizycja obrazu
- Rozpocznij rejestrowanie obrazów w odstępach 2 s za pomocą jednocześnie laserów 488 nm i 561 nm.
- Zmień zawór z trybu ręcznego na tryb wtryskowy, aby bufor obrazowania przepłukał próbkę białka do komory przepływowej po 60 s.
nuta: Proces ten potrwa ~30 s, a pole widzenia zostanie pokryte sygnałami mCherry, gdy tylko białka EWS-FLI1 dotrą do komórki przepływowej.
- Aby usunąć wolny EWS-FLI1, należy myć komorę przepływową buforem obrazowania przez 5 minut, gdy włączony jest tylko laser 561 nm. Zatrzymać przepływ i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
- Włącz przepływ z prędkością 0,4 ml/min, aby DNA się rozszerzyło, i uzyskuj obrazy w odstępach 2 s między różnymi ramkami, aby uzyskać wysokoprzepustowe dane dotyczące tworzenia kondensatu EWS-FLI1.
2. Analiza intensywności dla mCherry-EWS-FLI1
- Zaimportuj dane jako sekwencje obrazów do oprogramowania ImageJ, wybierz puncta w 25× witrynach GGAA w kwadracie o rozdzielczości 8×8 pikseli i zapisz obraz w .tif formacie.
- Oblicz intensywność jako sumę intensywności w kwadracie 8×8 pikseli, w tym całego punktu, i usuń tło, odejmując intensywność tła w obszarze o tym samym rozmiarze w pobliżu kwadratu 8x8 pikseli.