Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

Streszczenie

Źródło: Shengjuler, D., et al., -on-a-chip: Bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd. J. Vis. Exp. (2017)

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.

Protokół

1. Tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych (SLB)

1. Przenieść 100 μl SUV-ów zawierających PI(4,5)P2 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,65 ml. Doprowadzić pH roztworu do ~3,2 dodając 6,4 μl 0,2 N kwasu solnego.
   nuta: Potwierdzić pH roztworu za pomocą pH-metru wyposażonego w mikrosondę pH (patrz tabela materiałów).
2. Odpipetować 10 μl roztworu SUV o dostosowanym pH do każdego kanału przez wlot i wywierać ciśnienie przez pipetę, aż roztwór dotrze do wylotu. Odłącz końcówkę od pipety i pozostaw ją przymocowaną do urządzenia.
3. Powtórz powyższy krok dla każdego kanału, a następnie inkubuj urządzenie przez 10 minut w temperaturze RT.
   nuta: Iniekcja pęcherzyków do mikrokanalików powinna być wykonana bezpośrednio po montażu urządzenia.
4. Wytnij zestawy rurek wlotowych i wylotowych odpowiednio o długości 60 cm (rura wlotowa) i 8 cm (rurka wylotowa).
   nuta: Przecięcie rurki po przekątnej i utworzenie ostrej krawędzi ułatwia wkładanie rurki do wlotów i wylotów. Rurka wylotowa powinna mieć kształt łuku. Długość rurki dopływowej może się różnić w zależności od konfiguracji mikroskopu. Średnica wewnętrzna rurki wynosi 0,05 cm.
5. Za pomocą pęsety podłącz zestaw wężyków wylotowych do urządzenia, a następnie przyklej urządzenie do stolika mikroskopu.
6. Zanurz jeden koniec zestawu rurki wlotowej w 25 ml buforu roboczego zawartego w stożkowej rurce i przyklej go taśmą, aby upewnić się, że przewód jest zabezpieczony.
7. Umieść stożkową rurkę na wyższym podłożu (~20 cm) niż urządzenie, aby przepchnąć roztwór przez mikrokanaliki za pomocą przepływu grawitacyjnego; można w tym celu użyć podnośnika laboratoryjnego.
8. Do każdej rurki wlotowej użyj strzykawki, aby pobrać 1 ml buforu z wolnego końca rurki. Wyjmij końcówkę pipety z wlotu i włóż wolny koniec rurki wlotowej do urządzenia.
   nuta: Wprowadzić kroplę buforu roboczego na wlot, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wprowadzenia pęcherzyków powietrza do kanału podczas tego etapu. Po podłączeniu rurki dopływowej do urządzenia użyj niestrzępiącej się ściereczki, aby usunąć nadmiar bufora.
9. Powtórz powyższy krok, aby podłączyć wszystkie elementy rurki dopływowej do urządzenia.
   nuta: Przepływający bufor przepływowy przez kanały pomaga usunąć nadmiar pęcherzyków i zrównoważyć dwuwarstwę do warunków eksperymentalnych.
10. Otwórz oprogramowanie sterujące mikroskopem (patrz tabela materiałów). Na lewym panelu kliknij zakładkę "Mikroskop" i wybierz obiektyw "10X".
11. Kliknij ikony obrazu "Na żywo", a następnie "Alexa 568" na pasku narzędzi. Za pomocą pokręteł regulacji kursu i regulacji kursu skup się na mikrokanałach.
12. Przeskanuj urządzenie, aby sprawdzić jakość SLB i kanałów (Rysunek 1). Następnie kliknij ikonę obrazu "FL Shutter Closed" na pasku narzędzi.
13. Kliknij zakładkę "Akwizycja" i w sekcji "Podstawowe korekty" wybierz "Czas ekspozycji". Ustaw czas naświetlania na "200 ms".
14. Na lewym panelu kliknij "Multidimensional Acquisition" i pod menu filtrów wybierz czerwony kanał (oznaczony jako "Alexa 568"). Następnie kliknij menu "upływ czasu", ustaw przedział czasu na 5 minut, czas trwania na 30 minut i kliknij "Start".
    nuta: W zależności od czasu trwania (30 min) i natężenia przepływu (~1,0 μL/min), do zrównoważenia SLB w kanale używa się 30 μl bufora roboczego, tj. 240 μL bufora roboczego stosuje się dla wszystkich 8 kanałów.
15. Wybierz narzędzie "Okrąg" w zakładce "Zmierz" i narysuj okrąg w dowolnym kanale. Kliknij prawym przyciskiem myszy, gdy okrąg jest zaznaczony i wybierz "Właściwości". W zakładce "Profil" zaznacz "wszystkie T", aby wyświetlić intensywność fluorescencji w funkcji czasu.
    1. Upewnij się, że ta krzywa osiąga plateau, co wskazuje równowagę, zanim przejdziesz do następnego kroku.
16. Opuścić roztwór buforowy do równego podłoża co urządzenie, aby zatrzymać przepływ.
17. Zapisz plik poklatkowy.

2. Testowanie interakcji PLC-δ1 PH w domenie z SLB zawierającymi PI(4,5)P2

1. Przygotować rozcieńczenia domeny PH, używając uruchomionego buforu jako rozcieńczalnika.
   nuta: Ponieważ w urządzeniu znajduje się osiem kanałów, użyj co najmniej dwóch z nich do pustych elementów sterujących. Wybierz dalsze końce z każdej strony i użyj pozostałych kanałów do rozcieńczania białek. Badano następujące stężenia w domenie pH: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 i 2,50 μM. Około 200 μl każdego rozcieńczenia wystarczało do osiągnięcia równowagi w ciągu 30 minut.
2. Pojedynczo odłącz każdą rurkę wylotową i nałóż 200 μl każdego rozcieńczonego białka do kanału wylotowego za pomocą pipety. Nie wywieraj żadnego nacisku, pozwól, aby grawitacja wykonała pracę. Odłącz końcówkę od pipety i pozostaw ją przymocowaną do urządzenia mikroprzepływowego.
3. Powtórz powyższy krok dla każdego kanału i upewnij się, że podczas tego procesu do kanałów nie zostaną wprowadzone pęcherzyki powietrza.
4. Opuść rurkę wlotową na ziemię poniżej urządzenia mikroprzepływowego, aby rozpocząć przepływ białka przez mikrokanały. Przyklej wolny koniec rurki do pojemnika na odpady. Rozcieńczenia białka płynąć przez 30 min.
   nuta: Spowoduje to odwrócenie przepływu i umożliwi wprowadzenie białka do kanałów. Czas do zrównoważenia i objętość potrzebnych rozcieńczeń białek będą zależeć od powinowactwa oddziaływania.
5. W lewym panelu oprogramowania, w zakładce "Upływ czasu", kliknij "Start", aby ponownie rozpocząć obrazowanie.
6. Po zakończeniu eksperymentu zapisz plik poklatkowy.

Wyniki

Rysunek 1: Ocena integralności SLB i mikrokanałów. (A) Obraz ilustrujący wysokiej jakości SLB i mikrokanały. (B) Niepełna fuzja. (C) Stopione mikrokanały. (D) Cząstka pyłu uwięziona w mikrokanaliku. (E) Pęcherzyki powietrza uwięzione w mikrokanałach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina	Lipidy polarne Avanti	850457C	POPC
L-α-fosfatydyloinozytolo-4-fosforan	Lipidy polarne Avanti	840045X	PI4P (Czujnik PI4P
L-α-fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan	Lipidy polarne Avanti	840046X	PI(4,5)P2
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina	Lipidy polarne Avanti	850757C	papież; Wymagane do syntezy oSRB-POPE
Liszamina Rodamina B Chlorek sulfonylu (mieszanina izomerów)	ThermoFisher Naukowy	L-20	Wymagane do syntezy oSRB-POPE
Fluorescencyjna sonda lipidowa wrażliwa na pH (oSRB-POPE)	Na miejscu	N/a	Synteza wewnętrzna (Huang D. i in. 2013)
Mikroskop epifluorescencyjny Axiovert 200M	Mikroskopia Carla Zeissa	N/a	mikroskop
Kamera AxioCam MRm	Mikroskopia Carla Zeissa	N/a	kamera
X-Cite 120	Technologie Excelitas	N/a	Źródło światła
Zestaw filtrów Alexa 568	Mikroskopia Carla Zeissa	N/a	Ex/Em 576/603 nm
Oprogramowanie AxioVision LE64 v.4.9.1.0	Mikroskopia Carla Zeissa	N/a	Oprogramowanie do przetwarzania obrazu
Porady	Firma VWR	Numer katalogowy: 10034-132	końcówki do pipet 200 μl; Cienka i gładka końcówka do nakładania roztworu białkowego do kanału mikroprzepływowego
Porady	Firma VWR	53509-070	końcówki do pipet 10 μl; Cienka i gładka końcówka do nakładania roztworu pęcherzykowego do kanału mikroprzepływowego
pH-metr Orion Star A321	Thermo Scientific	STARA3210	pH-metr
Mikrosonda pH Orion	Thermo Scientific	8220BNWP	mikrosonda pH
Kwas N-(2-hydroksyetylo)-piperazyno-N'-(2-etanosulfonowy)	Firma VWR	VWRB30487	HEPES, Wolny kwas
chlorek sodu	Firma VWR	BDH8014-2,5 kg na sekundę	Zawartość NaCl
Rury	Allied Wire & Cable (Sprzymierzone przewody i	Przekaźnik TFT-200-24 N	Średnica wewnętrzna: 0,020-0,026 cala (0,051-0,066 cm); Grubość ścianki: 0,010 cala (0,025 cm); Elastyczne cienkościenne rurki z politetrafluoroetylenu; Naturalny kolor
Azot gazowy - przemysłowy	Linie lotnicze Praxair	N/a	Lokalny dostawca
Tlen gazowy - przemysłowy	Linie lotnicze Praxair	N/a	Lokalny dostawca
Ciekły azot	Linie lotnicze Praxair	N/a	Lokalny dostawca