$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
UWAGA: Poniżej przedstawiono kroki do badania przesiewowego fagów T7 rozpoznających leki za pomocą biosensora QCM i odzyskiwania przebadanych fagów poprzez zakażenie E. coli (BLT5615). Protokoły syntezy pochodnej małej cząsteczki, która tworzy samoorganizującą się monowarstwę (SAM) oraz budowy 15-merowej biblioteki losowych peptydów wyświetlanych przez T7, można znaleźć gdzie indziej.
1. Przygotowanie układu czujnika QCM
- Podłącz ceramiczny chip czujnika do oscylatora aparatu QCM 27 MHz i zarejestruj częstotliwość wewnętrzną (Hz) w fazie powietrznej przed unieruchomieniem małych cząsteczek.
- Odłącz chip i upuść 20 μl roztworu (1 mM w 70% etanolu) pochodnej małocząsteczkowej, która tworzy SAM, na złotą elektrodę chipa czujnika za pomocą pipety.
ostrożność: Kryształ chipa czujnika, w którym znajduje się złota elektroda (Au, grubość 0,1 mm, średnica wewnętrzna 2,5 mm, 4,9 mm2) jest niezwykle cienki i może łatwo pękać (SiO2, grubość 0,06 mm, średnica wewnętrzna 9 mm). Dlatego należy ostrożnie pipetować.
- Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (około 20 °C) na szalce Petriego z wilgotną chusteczką i osłoną przed światłem w pomieszczeniu.
- Delikatnie umyj powierzchnię elektrody ultraczystą wodą, a następnie usuń krople wody, przedmuchując powietrze strzykawką lub miotełką do kurzu.
- Skonfiguruj chip czujnika dla aparatu QCM i zarejestruj zmniejszenie częstotliwości w fazie powietrznej, aby zmierzyć ilość małej cząsteczki, która została unieruchomiona.
nuta: Co najmniej 100 Hz wewnętrznej częstotliwości jest niezbędne do udanego unieruchomienia małych cząsteczek (1 Hz unieruchamia 30 pg).
2. Biopanoramowanie biblioteki fagów T7 za pomocą biosensora QCM (Rysunek 1)
- Ustaw kuwetę z dedykowanym mieszadłem magnetycznym na biosensorze QCM i wlej 8 ml buforu reakcyjnego (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) do kuwety.
- Przymocuj układ czujnika QCM do oscylatora i pociągnij ramię oscylatora w dół, aby zanurzyć chip w mieszanym buforze z prędkością 1000 obr./min.
- Rozpocznij monitorowanie częstotliwości QCM na komputerze osobistym (PC) i poczekaj, aż sensorgram zrównoważy się do około 3 Hz/min dryftu częstotliwości.
- Wstrzyknąć 8 μl biblioteki fagów T7 (1-2 × 10pfu/ml) do kuwety (stężenie końcowe: 1-2 × 107 pfu/ml) i zaznaczyć punkt wstrzyknięcia na czujniku.
- Monitoruj zmniejszenie częstotliwości spowodowane wiązaniem fagów T7 z małą cząsteczką unieruchomioną na powierzchni złotej elektrody przez 10 minut.
- Zatrzymaj monitor częstotliwości QCM, wyjmij chip czujnika z oscylatora i usuń bufor, przedmuchując powietrze i/lub odprowadzając chusteczkami.
- Umieścić chip czujnika na wilgotnej szalce Petriego i wrzucić 20 μl zawiesiny E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5—1,0 po wstrząsaniu w temperaturze 37 °C przez dodanie IPTG do 1 mM) komórek gospodarza w fazie logarytmicznej na złotą elektrodę.
- Zamknij pokrywkę naczynia i przykryj ją folią aluminiową, aby zablokować światło.
- Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 30 minut na 96-dołkowym mieszalniku do mikropłytek (1000-1500 obr./min) w celu zwiększenia odzysku związanych fagów T7.
- Odzyskać 20 μl roztworu i zawiesić go w 200 μl pożywki LB.
nuta: Próbki otrzymane na tym etapie mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień.
- Przygotować serię rozcieńczeń roztworu fagowego do izolacji płytki nazębnej i sekwencjonowania DNA zgodnie z ogólną procedurą opisaną w instrukcjach producenta.
