$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie systemu
- Podłącz detektory MALS i dRI za detektorem UV FPLC. Pomiń detektory pH i przewodności, ponieważ dodadzą one znaczną objętość między detektorami UV i MALS. Użyć rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0,25 mm od kolumny do detektorów i między nimi oraz rurki kapilarne o średnicy wewnętrznej 0,75 mm na wyjściu detektorów do kolektora odpadów lub frakcji.
- Upewnij się, że zostały ustanowione niezbędne połączenia sygnałowe między FPLC a detektorami, w tym wyjście analogowe z detektora UV do wejścia analogowego MALS oraz wyjście cyfrowe z FPLC do automatycznego wstrzykiwania MALS za pośrednictwem skrzynki I/O FPLC.
- Zainstalować odpowiednią kolumnę analityczną SEC obejmującą zakres frakcjonowania od co najmniej 20 kDa do 500 kDa. Sprawdź informacje o produkcie, aby określić, czy kolumna jest odpowiednia dla zakresu MW, pH i innych właściwości próbki i fazy ruchomej.
2. Przygotowanie bufora, płukanie systemu przez noc i sprawdzenie czystości
- Używając odczynników klasy HPLC, przygotuj 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 50-100 mM NaCl. Przefiltrować bufor do 0,1 μm za pomocą filtra polieterowo-sulfonowego lub podobnego filtra w butelce. Przefiltruj pierwsze 50-100 ml buforu do butelki na odpady i wyrzuć, aby wyeliminować cząstki stałe z suchych filtrów, a następnie przefiltruj resztę do czystej, sterylnej butelki, która została dokładnie umyta przefiltrowaną, zdejonizowaną wodą i zakryta, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu.
nuta: Inne rozpuszczalniki fazy ruchomej, takie jak bufor Tris, mogą być stosowane, jeżeli mają być analizowane dodatkowe białka, które są preferencyjnie rozpuszczone w tych rozpuszczalnikach.
- Przepłukiwać przez noc z natężeniem przepływu 0,5 ml/min lub w inny sposób zalecany przez producenta kolumny, aby zrównoważyć kolumnę w buforze i usunąć cząstki stałe. Użyj trybu ciągłego przepływu FPLC i upewnij się, że przepływ nie zatrzyma się, dopóki wszystkie przebiegi SEC-MALS nie zostaną zakończone.
- Umieść celę przepływową dRI w trybie przedmuchiwania podczas płukania przez noc. Wyłącz przedmuchiwanie przed rozpoczęciem próbnych przebiegów.
- Rozpoczynając płukanie, stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, aby zapobiec efektowi "zrzucania kolumny" (lub uwalnianiu cząstek) spowodowanemu nagłą zmianą ciśnienia w kolumnie.
- Jeśli wiadomo, że system jest dość stabilny i wolny od cząstek stałych oraz znajduje się w równowadze z pożądaną fazą ruchomą, należy wymienić spłukiwanie nocne na krótsze, trwające 2-3 godziny.
- Sprawdź czystość systemu, lekko stukając w rurkę za kolumną, aby uwolnić nagromadzone cząstki i obserwując sygnał w detektorze 90° na wyświetlaczu na panelu przednim przyrządu MALS. Sprawdź, czy szum międzyszczytowy nie przekracza 50 -100 μV.
- Wykonać "ślepą" próbę wstrzyknięcia, aby sprawdzić, czy wtryskiwacz jest oczyszczony z cząstek stałych. "Ślepa próba" to po prostu bufor do biegania, przygotowany w świeżej, sterylnej fiolce.
- Jeśli pik cząstek nie przekracza objętości 1 ml i nie przekracza 5 mV powyżej linii podstawowej, oznacza to, że system jest gotowy do pobrania próbek. W przeciwnym razie wykonaj dodatkowe ślepe wstrzyknięcia, aż do wyczyszczenia, lub przeprowadź konserwację w celu wyczyszczenia wtryskiwacza.
3. Przygotowanie i załadunek próbki
- Przygotować co najmniej 200 μl BSA w stężeniu 1-2 mg/ml w buforze SEC.
nuta: Aby zapobiec wytrącaniu się osadów, BSA nigdy nie należy rozpuszczać w czystej wodzie.
- Przefiltruj białko do 0,02 μm za pomocą filtra z końcówką strzykawki.
- Wyrzuć kilka pierwszych kropli filtratu, aby wyeliminować cząstki z suchych filtrów.
- Alternatywnie, należy odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 15 minut, aby umożliwić wytrącanie nierozpuszczalnych agregatów i innych dużych cząstek.
- Wstrzyknąć 100 μl roztworu BSA do pętli.
nuta: Jest to zalecana ilość materiału, która może być wstrzykiwana w mniejszym lub większym stopniu w zależności od warunków próbki, takich jak stabilność lub dostępność. Ilość białka wymagana na wstrzyknięcie zmienia się odwrotnie proporcjonalnie do masy cząsteczkowej, dwa razy więcej masy białka jest potrzebne, jeśli masa cząsteczkowa wynosi 33 kDa lub połowę masy cząsteczkowej.
4. Przygotowanie oprogramowania MALS
- Otwórz nowy | Eksperymentuj z metody w menu oprogramowania MALS i wybierz metodę online z folderu metod systemu rozpraszania światła. Jeśli detektor DLS jest obecny, wybierz metodę Online z menu Rozpraszanie światła | Z folderem QELS.
- W sekcji Konfiguracja ustaw parametry próbki i fazy ruchomej.
- W widoku Pompa ogólna ustaw natężenie przepływu na używane w FPLC.
- W widoku Pompa ogólna, w polu Solvent branch, Name (Nazwa) wybierz PBS.
- W widoku Wtryskiwacz, gałąź Próbka, wprowadź nazwę jako BSA i ustaw dn/dc = 0,185 (standardowa wartość dla białek niemodyfikowanych), A2 = 0 i współczynnik ekstynkcji UV = 0,667 mL/(mg-cm).
nuta: W przypadku innych białek współczynnik ekstynkcji UV280 nm można znaleźć w literaturze lub obliczyć na podstawie jego sekwencji przy użyciu różnych narzędzi oprogramowania należących do domeny publicznej.
- W sekcji Procedury, w widoku Kolekcja podstawowa, zaznacz pole wyboru Wyzwalaj przy automatycznym wstrzykiwaniu i ustaw czas trwania przebiegu na 70 minut, aby dane były zbierane dla całej elucji, aż do osiągnięcia całkowitej objętości przenikania kolumny SEC.
nuta: Niezbędny czas może się różnić w zależności od kolumny i natężenia przepływu - dla standardowej kolumny HPLC-SEC o wymiarach 7,8 mm x 300 mm przy 0,5 ml/min wymagane jest 35 minut zbierania.
- Rozpocznij eksperyment w oprogramowaniu MALS, klikając przycisk Uruchom. Odczyt danych rozpocznie się po odebraniu sygnału impulsowego z instrumentu FPLC za pośrednictwem detektora MALS.
- Wyzeruj sygnał dRI, klikając przycisk Autozero na panelu przednim przyrządu.
5. Przygotowanie oprogramowania FPLC
- Wstaw nazwę białka i przebieg w oprogramowaniu FPLC, w Podręczniku | Wykonywanie instrukcji ręcznych | Ustaw znak.
- Przełącz zawór wtryskowy z obciążenia ręcznego na Wtrysk w ścieżce przepływu | Zawór wtryskowy.
- Dołącz sygnał impulsowy, wkładając impuls 0,5 s pod skrzynkę we/wy | Wyjście cyfrowe impulsu. Spowoduje to rozpoczęcie zbierania danych w oprogramowaniu MALS.
6. Wstrzyknij próbkę do pętli. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj) w oprogramowaniu FPLC, aby rozpocząć przebieg eksperymentu.