Method Article

Oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej w celu wyizolowania dwóch oddziałujących białek

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Hastings, J. F. et al. Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych metodą oczyszczania powinowactwa (BiCAP) za pomocą oczyszczania powinowactwa z uzupełnieniem bimolekularnym. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie pokazaliśmy oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej, BiCAP, do wykrywania i izolowania specyficznych dimerów białkowych za pomocą specyficznych dla konformacji przeciwciał jednodomenowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

UWAGA: Dla transfekcji wektorów BiFC ważne jest osiągnięcie wysokiej wydajności i względnie jednorodnej transfekcji. Wektory będą prawdopodobnie kompatybilne z dowolnym standardowym odczynnikiem do transfekcji, a warunki transfekcji powinny być odpowiednio zoptymalizowane. Aby przeprowadzić spektrometrię mas, zwykle hodujemy komórki w odległości 10 cm od szalek, chociaż można to również proporcjonalnie zmniejszyć do mniejszych szalek lub płytek w przypadku eksperymentów, które wymagają mniejszej ilości materiału.

  1. Nasiona 1.0 × 106 HEK293T komórek w 1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM (DMEM)Gibco (firma Gibco)Numer katalogowy 11995-073Hodowla komórkowa
FBS (Sieć UsługowaTechnologie życiowe AustraliaNumer katalogowy: 10099-141Hodowla komórkowa
Penicylina/StreptomycynaTechnologie życiowe AustraliaNumer katalogowy: 15070-063Hodowla komórkowa
Bufor transfekcyjny jetPRIMEPoliplus114-15Hodowla komórkowa
Odczynnik do transfekcji jetPRIMEPoliplus114-15Hodowla komórkowa
PhosSTOP (inhibitor fosfatazy)Sigma-Aldrich4906837001Hodowla komórkowa
Kompletny, mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazyRoche11873580001Wyroby z tworzyw sztucznych
Skrobak do komórekSarstedt83.1832 Rozdział 1832
GFP-Trap_AChromotek Gmbhgta-100GFP nanobody sprzężony z koralikami agarozy
N-końcowe przeciwciało monoklonalne GFPCovance (Kot)MMS-118PWykryje tag V1 w wektorach BiFC
C-końcowe przeciwciało monoklonalne GFPRoche11814460001Wykryje tag V2 w wektorach BiFC
Bufor do pobierania próbekInvitrogenNP0008Uzupełniony 1 ml β-merkaptoetanolu.
Trypsyna modyfikowana do sekwencjonowaniaKorporacja PromegaV5117hHodowla komórkowa
Probówki do mikrowirówek LoBindDiagnostyka w miejscu opieki nad pacjentemNumer telefonu 0030 108 116Wyroby z tworzyw sztucznych
JodoacetamidSigma-AldrichI1149-5GPrzygotowany w stężeniu 5 mg/ml w wodzie ultraczystej
LTQ Orbitrap Velos ProRybak termiczny
Komórki DH5αRybak termicznyOgniwa kompetentne w przypadku szoku cieplnego
powiedział: powiedział: powiedział:

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bimolecular ComplementationAffinity PurificationProtein Interaction DetectionFluorescence MicroscopyAgarose BeadsWestern BlottingSDS PAGECell LysisTransfection ReagentHEK293T Cells

Related Articles