Oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej w celu wyizolowania dwóch oddziałujących białek

Streszczenie

Źródło: Hastings, J. F. et al. Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych metodą oczyszczania powinowactwa (BiCAP) za pomocą oczyszczania powinowactwa z uzupełnieniem bimolekularnym. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie pokazaliśmy oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej, BiCAP, do wykrywania i izolowania specyficznych dimerów białkowych za pomocą specyficznych dla konformacji przeciwciał jednodomenowych.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

UWAGA: Dla transfekcji wektorów BiFC ważne jest osiągnięcie wysokiej wydajności i względnie jednorodnej transfekcji. Wektory będą prawdopodobnie kompatybilne z dowolnym standardowym odczynnikiem do transfekcji, a warunki transfekcji powinny być odpowiednio zoptymalizowane. Aby przeprowadzić spektrometrię mas, zwykle hodujemy komórki w odległości 10 cm od szalek, chociaż można to również proporcjonalnie zmniejszyć do mniejszych szalek lub płytek w przypadku eksperymentów, które wymagają mniejszej ilości materiału.

1. Nasiona 1.0 × 10⁶ HEK293T komórek w 10 cm naczyniu z 10 ml pożywki DMEM, uzupełnionej 10% FBS i penicyliną/streptomycyną (1:100).
2. Rozcieńczyć 2,5 μg każdego wektora BiFC w 500 μl buforu transfekcyjnego (patrz tabela materiałów) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
3. Dodać 10 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów).
4. Wiruj mieszaninę przez 10 s, a następnie krótko odwiruj. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Dodaj mieszaninę transfekcji DNA do płytki, kroplami. Inkubuj komórki przez wystarczająco długi czas, aby białka fuzyjne BiFC mogły oddziaływać oraz aby Wenus składała się i dojrzewała fluorofor, zwykle ~ 8 - 24 godziny < br / > UWAGA: Szczytowe wzbudzenie Wenus wynosi 515 nm, a jej szczytowa emisja wynosi 528 nm, chociaż można to łatwo zobaczyć za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego ustawionego do wizualizacji fluorescencji GFP.

2. Przygotowanie próbki

1. Zbiór lizatów
   1. Przed pobraniem lizatu należy przygotować bufor do lizy komórek [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) niejonowy detergent (patrz tabela materiałów)]. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Bezpośrednio przed zbiorem należy uzupełnić 10 ml buforu do lizy komórek inhibitorem proteazy i inhibitorem fosfatazy (patrz tabela materiałów). Uzupełniony bufor do lizy komórek należy przechowywać na lodzie.
   3. Umyj komórki dwukrotnie w lodowatym PBS. Odessać PBS i dodać 1 ml lodowatego buforu do lizy komórek. Umieść naczynie na lodzie, upewniając się, że bufor jest rozprowadzony na całej powierzchni.
   4. Inkubować na lodzie przez około 5 minut, a następnie użyć skrobaka do komórek (patrz tabela materiałów), aby zeskrobać komórki i przenieść je do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   5. Usunąć resztki komórkowe poprzez odwirowanie zebranego lizatu w stężeniu 18 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i przenieść oczyszczony supernatant do świeżych probówek do mikrowirówek.
      nuta: W tym momencie lizat może być natychmiast użyty lub przechowywany w temperaturze -80 °C. Zaleca się również przechowywanie podwielokrotności surowego lizatu, aby można było potwierdzić skuteczność transfekcji i oczyszczania powinowactwa.
2. Oczyszczanie powinowactwa
   nuta: Etap izolacji BiCAP przeprowadza się przy użyciu nanonury GFP sprzężonej z kulkami agarozy (patrz Tabela materiałów).
   1. Przygotować kulki agarozy, przemywając odpowiednią objętość (20 μl na próbkę + 10 μl nadmiaru) w 1 ml PBS. Odwirować kulki o sile 300 x g i usunąć supernatant.
   2. Dodać 20 μl do każdej próbki lizatu.
   3. Próbki inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C z rotacją od końca do końca.
      nuta: Na tym etapie próbki można przygotować do SDS-PAGE i western blotting lub do analizy za pomocą spektrometrii mas.
3. Przygotowanie eluentu BiCAP do western blot.
   1. Odwirować kulki o masie 300 x g i umyć je trzykrotnie w buforze do lizy komórek.
   2. Ponownie zawiesić przemyte kulki w 50 μl odpowiednio rozcieńczonego buforu do próbek (patrz tabela materiałów) i podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 2-3 minuty
      nuta: Tak przygotowane próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
   3. Wykonaj SDS-PAGE i western blot zarówno dla znaczników V1, jak i V2 (patrz Tabela materiałów), a także dla wszelkich innych interesujących białek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM (DMEM)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 11995-073	Hodowla komórkowa
FBS (Sieć Usługowa	Technologie życiowe Australia	Numer katalogowy: 10099-141	Hodowla komórkowa
Penicylina/Streptomycyna	Technologie życiowe Australia	Numer katalogowy: 15070-063	Hodowla komórkowa
Bufor transfekcyjny jetPRIME	Poliplus	114-15	Hodowla komórkowa
Odczynnik do transfekcji jetPRIME	Poliplus	114-15	Hodowla komórkowa
PhosSTOP (inhibitor fosfatazy)	Sigma-Aldrich	4906837001	Hodowla komórkowa
Kompletny, mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11873580001	Wyroby z tworzyw sztucznych
Skrobak do komórek	Sarstedt	83.1832 Rozdział 1832
GFP-Trap_A	Chromotek Gmbh	gta-100	GFP nanobody sprzężony z koralikami agarozy
N-końcowe przeciwciało monoklonalne GFP	Covance (Kot)	MMS-118P	Wykryje tag V1 w wektorach BiFC
C-końcowe przeciwciało monoklonalne GFP	Roche	11814460001	Wykryje tag V2 w wektorach BiFC
Bufor do pobierania próbek	Invitrogen	NP0008	Uzupełniony 1 ml β-merkaptoetanolu.
Trypsyna modyfikowana do sekwencjonowania	Korporacja Promega	V5117h	Hodowla komórkowa
Probówki do mikrowirówek LoBind	Diagnostyka w miejscu opieki nad pacjentem	Numer telefonu 0030 108 116	Wyroby z tworzyw sztucznych
Jodoacetamid	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Przygotowany w stężeniu 5 mg/ml w wodzie ultraczystej
LTQ Orbitrap Velos Pro	Rybak termiczny
Komórki DH5α	Rybak termiczny		Ogniwa kompetentne w przypadku szoku cieplnego

powiedział: powiedział: powiedział: