1. Przygotowanie próbki
- Oczyść pożądaną biomolekułę.
nuta: Protokół ten wykorzystuje zakupiony aptamer DNA wiążący kokainę MN4 po trzykrotnej wymianie na 2 M NaCl, a następnie trzech rundach dejonizowanej wody przy użyciu filtra odśrodkowego z membraną odcinającą masę cząsteczkową 3 kDa.
- Zsyntetyzuj i oczyść lub kup żądany ligand termolabilny.
nuta: MN4 wiąże termolabilny ligand kokainę. MN4 wiąże również chininę, która jest stosowana jako ujemna kontrola termolabilności ligandów w tych temperaturach eksperymentalnych.
- Przygotować do dializy oczyszczonej biomolekuły i rozpuszczenia ligandów (20 mM fosforanu sodu i 140 mM buforu NaCl, pH 7,4, dla MN4 i stosowanych tu ligandów).
- Dializować biomolekułę w stosunku do co najmniej 2 l buforu za pomocą rurki dializacyjnej z odcięciem 0,5 - 1,0 kDa.
- Przefiltruj końcowy bufor (określany jako bufor roboczy) przez filtr 0,2 μm, który został dokładnie zrównoważony z buforem.
- Odważyć żądane masy ligandów i rozpuścić je w przefiltrowanym buforze roboczym. Jeśli pożądane stężenia ligandów wymagają mas, które są zbyt małe, aby można je było dokładnie zważyć, należy przygotować stężony roztwór podstawowy liganda (10x na przykład).
nuta: Bardzo ważne jest, aby wszystkie eksperymenty DSC wykorzystywały ten sam bufor roboczy dla próbki i liganda, tj. nigdy nie wykonuj eksperymentu, w którym ligand jest rozpuszczony w innej partii buforu roboczego niż biomolekuła, ponieważ spowoduje to artefakty niedopasowania bufora w danych.
- Przefiltrować roztwór podstawowy biomolekuły przez filtr 0,2 μm, który został dokładnie zrównoważony z buforem roboczym.
- Określ stężenie biomolekuły za pomocą pomiarów absorbancji (260 nm dla kwasów nukleinowych, takich jak MN4 i 280 nm dla białek).
- Przygotować biomolekułę i ligand należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C (odpowiedniej dla MN4 i stosowanych tu ligandów) lub w temperaturze -20 lub -80 °C, jeśli biomolekuła i ligandy tolerują zamrażanie i wymagane jest długotrwałe przechowywanie. Odgazowanie roztworów buforu, biomolekuły i liganda w odgazowywaczu stołowym (patrz Tabela materiałów) przed załadowaniem do DSC.
nuta: Odgazowanie pomaga zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków w DSC w wyższych temperaturach. Bąbelki powodują artefakty sygnału, które zasłaniają kształty pików DSC i linie bazowe.
2. Przygotowanie DSC
- Odkręć uchwyt dociskowy od DSC (patrz Tabela materiałów).
- Poprowadź rurkę silikonową z bufora roboczego i przymocuj ją do przedniego kołnierza (metalowego otworu) kapilary odniesienia.
- Utwórz most między kapilarą odniesienia a kapilarą próbki, łącząc tylny kołnierz odniesienia z przednim kołnierzem próbki.
- Podłącz kawałek silikonowej rurki do tylnego kołnierza próbki, który biegnie do kolby na odpady z podłączonym przewodem próżniowym.
- Włącz linię podciśnieniową, aby przepłukać DSC 200 ml działającego buforu.
- Załaduj kapilarnę referencyjną DSC buforem roboczym. Przymocuj około 3-5 cm odcinki rurki silikonowej do referencyjnych kołnierzy kapilary.
- Włóż końcówkę pipety o pojemności 1 ml do silikonowej rurki tylnego kołnierza. Pobrać 0,8 ml buforu roboczego za pomocą pipety i włożyć końcówkę pipety z buforem do silikonowej rurki przedniego kołnierza odniesienia.
- Delikatnie dociśnij tłok pipety w dół, aby przepuścić bufor roboczy przez przednią silikonową rurkę do kapilary referencyjnej i w górę do końcówki pipety dołączonej do tylnego kołnierza. Docisnąć tłok pipety, aż poziom bufora roboczego znajdzie się tuż nad przednią rurką silikonową, a następnie zwolnić tłok pipety, aż poziom buforu roboczego znajdzie się tuż nad tylną rurką silikonową.
- Powtórz przepuszczanie buforu roboczego tam iz powrotem, aby oczyścić objętość z pęcherzyków w kapilarze odniesienia.
nuta: Zwykle 10 przejść roztworu tam iz powrotem wystarcza, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
- Zakryj tylną końcówkę pipety kciukiem i delikatnie pociągnij do góry tylną końcówkę pipety i przednią pipetę, aby wyjąć je z kołnierzy odniesienia z dołączoną silikonową rurką.
- Załadować kapilar próbki buforem roboczym, jak w krokach 2.6 - 2.9. Umieść czarną plastikową nasadkę na tylnym odnośniku i sample kołnierze, pozostawiając przednie kołnierze odkryte.
- Zamocuj uchwyt dociskowy.
- Otwórz oprogramowanie DSC (patrz Tabela materiałów) i zwiększ ciśnienie w urządzeniu, klikając czerwoną strzałkę w górę u góry interfejsu, gdy odczyt mocy się ustabilizuje; moc DSC jest wskazywana w polu w prawym górnym rogu interfejsu wraz z odczytem temperatury i ciśnienia przyrządu.
nuta: Monitoruj odczyt mocy, gdy ciśnienie w DSC rośnie. Zmiany mocy powyżej ~ 10 μW wskazują na tworzenie się pęcherzyków w naczyniach włosowatych, które mogą powodować artefakty w danych. Przed kontynuowaniem roztwory należy usunąć i dalej odgazować.
- Zrównoważ DSC z buforem roboczym, wykonując skanowanie do przodu i do tyłu. W zakładce "Metoda eksperymentalna" po lewej stronie ekranu upewnij się, że wybrana jest opcja "Skanowanie", aby uruchomić DSC w trybie skanowania temperatury.
nuta: Parametry eksperymentalne to zakres skanowania temperatury, szybkość skanowania, czas równoważenia niskiej i wysokiej temperatury oraz liczba skanów.
- W polu "Parametry temperatury" w zakładce "Metoda eksperymentalna" kliknij przycisk "Ogrzewanie". Wprowadź 1 i 100 °C dla dolnej i górnej temperatury doświadczalnej, 1 °C/min dla szybkości skanowania i 60 s dla okresu równowagi.
- Kliknij przycisk "Dodaj serię" pod polem wprowadzania dla okresu równowagi. Wpisz 2 w polu "Kroki do dodania" w wyskakującym okienku (dla jednego skanowania ogrzewania i jednego chłodzenia) i zaznacz pole "Alternatywne ogrzewanie/chłodzenie". Kliknij "OK"; Dodane skany pojawiają się w dolnej części interfejsu. Sprawdź, czy parametry każdego skanowania są zgodne z oczekiwaniami.
- Rozpocznij eksperyment, klikając zielony przycisk "odtwórz" u góry interfejsu. Przejdź do żądanego folderu i wprowadź nazwę pliku, aby zapisać eksperyment w wyskakującym okienku. Aby sprawdzić postęp eksperymentu, kliknij kartę "Dane" po prawej stronie karty "Metoda eksperymentu".
3. Zbieranie zestawów danych DSC dla ligandów termolabilnych
UWAGA: Minimalna procedura składa się z pięciu eksperymentów: eksperymentów referencyjnych z ligandem i bez niego (używanych do odejmowania linii podstawowej), eksperymentów z próbkami z wolną biomolekułą, biomolekułą związaną z ligandem oraz biomolekułą związaną z ligandem z dłuższym okresem równowagi w wysokiej temperaturze.
- Uruchom eksperymenty referencyjne w celu odjęcia linii bazowej przykładowych danych. Załaduj DSC z buforem roboczym w obu kapilarnach i zbierz wiele skanów do przodu i do tyłu w odpowiednim zakresie temperatur w temperaturze 1 °C min-1 z górnym (wysokotemperaturowym) czasem równowagi wynoszącym 120 s.
- Usuń poprzednie skany równoważenia bufora z dolnej części interfejsu, podświetlając każdy z nich osobno i klikając czerwony X w prawym środkowym rogu interfejsu. Dodaj nowe skany, klikając przycisk "Dodaj serię", wpisując 20 w polu "Kroki do dodania" i zaznaczając pole "Alternatywne ogrzewanie/chłodzenie". Kliknij przycisk OK i uruchom eksperyment, klikając zielony przycisk odtwarzania, jak powyżej.
- Powtórzyć kroki 3.1 - 3.1.1 z buforem roboczym zawierającym pożądane stężenie liganda w obu naczyniach włosowatych, aby uzyskać doświadczenia referencyjne dla liganda (zebrać dwa oddzielne doświadczenia, stosując odpowiednio czasy równowagi wysokotemperaturowej 120 s i 600 s, które zostaną wykorzystane do uzyskania stałej szybkości dla termolabilnej konwersji liganda).
nuta: Zastosowana tutaj szybkość skanowania zapewnia, że biomolekuła w kolejnych eksperymentach jest w równowadze termicznej w skanach do przodu i do tyłu. Szybkość skanowania < 0,1 - 0,2 °C min-1 prowadzi do hałaśliwych termogramów i nie ma zastosowania w eksperymentach DSC. Temperatury powinny wahać się od temperatury znacznie poniżej temperatury topnienia wolnej biomolekuły do znacznie powyżej temperatury topnienia biomolekuły nasyconej ligandem (~ 20 - 80 °C dla MN4). Sprawdź odtwarzalność skanów (na przykład wystarczy 10 skanów do przodu i 10 skanów wstecznych, co daje łącznie 20).
- W przypadku stosowania wielu ligandów (takich jak kokaina i chinina), należy przepłukać DSC 200 ml buforu roboczego (powtórzyć od kroku 2.5) między seriami, aby usunąć ligandy z naczyń włosowatych i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
nuta: Pomocne jest przeprowadzenie powtórzonego eksperymentu na wolnej biomolekułce po przebiegu związanym z ligandem w celu sprawdzenia, czy poprzedni ligand silnie adsorbuje się na ściankach naczyń włosowatych i nie jest odpowiednio usuwany przez przepłukiwanie buforu. Jeśli termogramy dla wolnej biomolekuły wydają się być przesunięte do większej wielkości i wyższej temperatury denaturacji po eksperymencie związanym z ligandem, jest prawdopodobne, że poprzedni ligand jest nadal obecny w kalorymetrze po przepłukaniu. Usunąć zaadsorbowany ligand przez inkubację naczyń włosowatych z 20% Contrad-70 przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C z plastikowymi nasadkami i zdjętym uchwytem dociskowym. W oprogramowaniu DSC zmień tryb eksperymentalny na "Izotermalny" w zakładce Metoda eksperymentalna. Wybierz 3 600 s jako czas trwania i 60 °C jako temperaturę izotermiczną, z zerem wprowadzonym jako czas równowagi. Kliknij "Dodaj do metody eksperymentalnej". Eksperyment izotermiczny pojawia się w dolnej części ekranu. Po zakończeniu przepłucz przyrząd 2 litrami wody dejonizowanej i powtórz od kroku 2.5.
- Uruchom eksperymenty z próbkami przy użyciu tej samej procedury ładowania DSC i parametrów eksperymentalnych, co skany referencyjne. W przypadku wolnego zbioru danych biomolekuł należy upewnić się, że kapilara referencyjna zawiera bufor roboczy, podczas gdy kapilara próbki zawiera wolną biomolekułę w pożądanym stężeniu w buforze roboczym.
- W przypadku doświadczeń związanych z ligandem należy upewnić się, że ligand znajduje się w buforze roboczym w kapilarze odniesienia, a biomolekuła plus ligand znajdują się w buforze roboczym w kapilarze próbki. Przepłukać system między dodatkami różnych ligandów, jak w kroku 2.5.
- Wykonać jeden dodatkowy eksperyment z biomolekułą związaną z ligandem termolabilnym, w którym okres równowagi wysokotemperaturowej wydłuża się do 600 s, a wszystkie inne parametry doświadczalne są takie same jak w kroku 3.2.1.
nuta: Czas trwania okresu równowagi w wysokiej temperaturze dla drugiego eksperymentu związanego z ligandem jest po prostu wybierany tak, aby zapewnić, że ligand ulega szybszemu wyczerpaniu niż w doświadczeniu z krótkim czasem równowagi. Jeśli piki związane z ligandem z pierwszego doświadczenia rozpadają się powoli w funkcji liczby skanowania (np. różnice w kolejnych maksimach pików wynoszą ≤ 0,5 °C), należy oszacować 10- do 20-krotny wzrost okresu równowagi w wysokiej temperaturze, aby odpowiednio zubożyć ligand podczas drugiego eksperymentu. Dokładne obliczenie stałej szybkości konwersji ligandów wymaga, aby w drugim eksperymencie nastąpiło szybsze wyczerpanie liganda w stosunku do pierwszego. Stężenia ligandów uzyskane z globalnej analizy dwóch eksperymentów będą podobne, a zatem bezużyteczne, jeśli zubożenie ligandów nie zostanie wystarczająco przyspieszone w drugim doświadczeniu.
4. Przetwarzanie danych
- Otwórz pliki eksperymentu DSC w oprogramowaniu do analizy danych DSC (patrz Tabela materiałów) i wyeksportuj surowe dane dotyczące mocy jako arkusze kalkulacyjne.
- Zaimportuj arkusze kalkulacyjne zawierające surowe dane dotyczące mocy do oprogramowania w celu dopasowania danych.
- Linia bazowa Odejmij dane próbki, odejmując dane dotyczące mocy bufora z eksperymentów z biomolekułami swobodnymi i związanymi z ligandem.
nuta: W eksperymencie z ligandem termolabilnym stężenie początkowego liganda zmniejsza się z każdym skanem. Dlatego idealnym rozwiązaniem jest odjęcie skanu bufora 1 od skanu próbki 1 i tak dalej. Odkryliśmy, że skany buforowe z kokainą nie zmieniają się znacząco w miarę postępu konwersji liganda, a zatem pojedynczy termolabilny skan bufora liganda może być użyty do odjęcia wszystkich danych związanych z termolabilnym ligandem.
- Przelicz odjęte od linii bazowej dane dotyczące mocy próbki na pojemność cieplną.
nuta: Konwersja wymaga częściowej objętości właściwej biomolekuły, którą można oszacować.
5. Analiza danych
- Globalnie dopasuj zestaw danych o pojemności cieplnej związanej z ligandem o krótkim czasie równowagi z pojedynczym zestawem parametrów linii podstawowej, stężenia liganda, fałdowania i wiązania liganda.
- Powtórz dopasowanie globalne dla zestawu danych długiego czasu równowagi, aby obliczyć stałą szybkości konwersji ligandów termolabilnych.
