$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie CXCL12, bufora testowego i komórek Jurkata do testu wiążącego konkurencję
- Przygotować roztwór podstawowy CXCL12AF647 (20 μg/ml; patrz Tabela Materiałów i Odczynników) rozpuszczając liofilizowany odczynnik (przechowywany w temperaturze -80 °C, w ciemności) w ultraczystej wodzie uzupełnionej 0,01% (objętość/objętość) polisorbatu 20. Podwielokrotności jednorazowego użytku z tego roztworu podstawowego należy przechowywać w temperaturze -80 °C, chroniąc przed światłem.
- Przygotować bufor testowy, dodając 40 ml HEPES (1 M, 20 mM stężenie końcowe) do 200 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS, 10x, bez czerwieni fenolowej i bez wodorowęglanu sodu, 1x stężenie końcowe). Dodać ultraczystą wodę, aby uzyskać końcową objętość 2 l. Dodać 4 g (0,2% wagowo-objętościowo) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i rozpuścić BSA przez mieszanie magnetyczne. Na koniec dostosuj pH do 7,4 (użyj do tego NaOH) i przefiltruj roztwór przez pory 0,2 μm (patrz Tabela materiałów i odczynników) za pomocą kolektora próżniowego.
UWAGA: Ten bufor testowy będzie używany we wszystkich dalszych etapach protokołu.
- Policz liczbę i żywotność komórek Jurkat. W tym celu należy pobrać próbkę zawiesiny komórkowej i rozcieńczyć ją w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
nuta: Rutynowo używamy zautomatyzowanego analizatora żywotności komórek (patrz Tabela materiałów i odczynników) zdolnego do zliczania zawiesin komórek w różnych stężeniach. Do liczenia komórek rozcieńczyć 0,5 ml zawiesiny komórek w 1,5 ml PBS (możliwe są również inne rozcieńczenia, np. 0,1 ml w 1,9 ml PBS). Na rynku dostępnych jest kilka innych urządzeń do zliczania liczby komórek i żywotności, które powinny działać równie dobrze.
- Zebrać żądaną liczbę komórek (tj. ~24 x 106 komórek, aby uruchomić test z jedną kompletną 96-dołkową płytką) w sterylnej probówce o pojemności 50 ml przez odwirowanie (patrz Tabela materiałów i odczynników dla rodzaju użytej wirówki) przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Delikatnie odlać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Dodać świeży bufor do oznaczania (np. 20 ml) i ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół.
- Ponownie odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Ponownie odlać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w świeżym buforze do oznaczania, aby uzyskać gęstość 5 x 106 komórek/ml.
2. Test wiążący konkurencję
UWAGA: Rzeczywisty test wiążący konkurencję jest wykonywany w RT i może być wykonywany w warunkach niesterylnych.
- Rozcieńczyć badane związki w buforze do oznaczania (patrz 1.2) w celu uzyskania pożądanego stężenia. Przygotować stałe stężenie związku do wstępnego badania przesiewowego (np. 10 μM stężenie końcowe) lub, alternatywnie, serię seryjnych rozcieńczeń stężeń w celu bardziej szczegółowej charakterystyki związków (np. seria rozcieńczeń 1/3, 1/4 lub 1/5, zaczynając od 1 μM, stężenie końcowe). Należy pamiętać, że roztwór związku zostanie ostatecznie 2x rozcieńczony w teście; Dlatego przygotuj 2x stężony roztwór.
- Dozować 100 μl roztworu złożonego (2x stężonego) do przezroczystej 96-dołkowej okrągłej płytki dennej (patrz Tabela materiałów i odczynników) zgodnie z wcześniej zdefiniowanym układem doświadczalnym (np. Rysunek 1C).
UWAGA: Na tym etapie do testu włącza się ujemne i dodatnie próbki kontrolne. W ujemnej próbce kontrolnej dodaje się 100 μl buforu do oznaczania zamiast związku do studzienek płytki 96-dołkowej. W przypadku dodatniej próbki kontrolnej na tym etapie dodaje się również bufor do oznaczania. Na rysunku 1C przedstawiono również typowy układ doświadczalny, w którym bada się szereg rozcieńczeń kilku związków.
- Dodać 50 μl zawiesiny komórek (patrz 1.7; 0,25 x 106 komórek) ze zbiornika odczynnika do płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Dodaj 50 μl znakowanego fluorescencyjnie CXCL12 (tj. 100 ng/ml CXCL12AF647 w buforze testowym, 4x zagęszczony, 25 ng/ml stężenie końcowe) z podobnego zbiornika odczynnika do dołków płytki 96-dołkowej. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
nuta: W przypadku ujemnych próbek kontrolnych należy zamiast tego dodać bufor do oznaczania. W związku z tym sygnał fluorescencyjny wykryty w ujemnych próbkach kontrolnych będzie odpowiadał autofluorescencyjnemu sygnałowi tła (rysunek 1A). W przypadku dodatnich próbek kontrolnych dodać 50 μl/basenik CXCL12AF647. Próbki kontroli dodatniej dadzą maksymalny wykryty sygnał fluorescencji, ponieważ nie uwzględniono potencjalnego hamowania przez wstępną inkubację ze związkami (ryc. 1A).
- Odwirować 96-dołkową płytkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant z granulowanych komórek, odwracając płytkę. Osusz płytkę na chusteczce.
- Dodać 200 μl świeżego buforu do oznaczania ze zbiornika odczynnika do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Natychmiast kontynuuj.
- Ponownie odwirować płytkę przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant przez odwrócenie płytki i ponownie wysuszyć ją na chusteczce.
- Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 200 μl 1% paraformaldehydu rozpuszczonego w PBS. Ten krok naprawi komórki.
- Natychmiast kontynuować postępowanie z protokołem, dokonując ilościowego oznaczania fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej.
3. Analiza próbek metodą cytometrii przepływowej
CXCL12AF647 barwione i utrwalone komórki są teraz gotowe do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Można zastosować kilka rodzajów cytometrów przepływowych, ale muszą one być wyposażone w odpowiedni laser (tj. laser czerwony, zakres wzbudzenia ~630 nm) do wzbudzenia oraz odpowiednie filtry do wykrywania fluoroforów (filtry emisyjne ~660 nm). Muszą one być zdolne do pracy z próbkami w formacie płytki 96-dołkowej. Przykłady odpowiednich urządzeń do cytometrii przepływowej podano w tabeli materiałów i odczynników.
- Uruchom urządzenie i otwórz odpowiednie oprogramowanie (patrz Tabela materiałów i odczynników).
- Wybierz następujące parametry komórkowe, które mają być wizualizowane w formacie kropki: rozproszenie do przodu (FSC), rozproszenie boczne (SSC) i kanał wykrywania fluoroforu (CXCL12AF647).
nuta: Dzięki parametrowi FSC komórki są rozróżniane na podstawie ich wielkości, ponieważ wykryta absorpcja światła jest proporcjonalna do średnicy ogniwa. Parametr SSC, mierzący rozproszenie światła pod kątem 90°, dostarcza informacji o ziarnistości komórek.
- Należy wybrać jedną próbkę (np. próbkę kontroli ujemnej) w celu przeprowadzenia bramkowania określonej jednorodnej populacji komórek w oparciu o parametry FSC i SSC.
- Wybierz automatyczne wstrzyknięcie ~100 μl utrwalonych komórek z tej próbki kontroli ujemnej do cytometru przepływowego. Przed wstrzyknięciem należy wybrać opcję "mieszanie" i użyć natężenia przepływu próbki 1,5 μl/s.
- Uruchom ten przykład, wybierając opcję "Acquire Data" (Uzyskaj dane). Parametry FSC i SSC dla tej próbki pojawią się teraz na ekranie.
- Wybierz narzędzie do bramkowania oprogramowania. Na podstawie wizualizacji fsc i SSC dot blot wstępnie zdefiniuj jednorodną i żywotną populację komórek przez bramkowanie. Aby to zrobić, utwórz wielokąt (za pomocą narzędzia do bramkowania oprogramowania), który zawiera jednorodnie rozmieszczone pojedyncze komórki ("zdarzenia") oparte na tych dwóch wymiarach.
nuta: Procedura bramkowania ma na celu zdefiniowanie jednorodnej i żywotnej populacji komórek, która zostanie wykorzystana do dalszej analizy. Bramkowanie opiera się na założeniu, że większość żywotnych komórek utworzy jednorodną populację komórek w oparciu o parametry FSC i SSC. Wykonując ten krok, można w dużej mierze wykluczyć z dalszej analizy szczątki komórkowe, martwe komórki i agregaty komórkowe. Ilustracja procesu bramkowania znajduje się na rysunku 1B.
- Wybierz tę opcję, aby przeanalizować 20 000 "zdarzeń" (tj. pojedynczych komórek) na próbkę.
nuta: Oznacza to, że dla każdej próbki ostatecznie analizowanych będzie 20 000 komórek, które mieszczą się w predefiniowanej bramce. Akwizycja danych dla każdej próbki będzie kontynuowana do momentu przeanalizowania tej liczby zdarzeń.
- Rozpocznij przebieg (wybierz "Nagraj dane"). Urządzenie do cytometrii przepływowej będzie teraz analizować wszystkie próbki jedna po drugiej, rejestrując średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla każdej próbki. Ten MFI odpowiada średniemu sygnałowi fluorescencyjnemu odpowiadającemu 20 000 komórek, które mieszczą się w predefiniowanej bramce.
