1. Generowanie plazmidu, który wyraża konstrukt chimeryczny
UWAGA: Celem jest wygenerowanie plazmidu, który wyraża zewnątrzkomórkową domenę interesującego nas receptora, połączoną z domenami transbłonowymi i wewnątrzkomórkowymi mysiego łańcucha CD3ζ (Rysunek 1A).
- Pobierz sekwencję domeny zewnątrzkomórkowej receptora będącego przedmiotem zainteresowania, w tym peptydu sygnałowego. Uzyskaj materiał DNA, który ma wyrażać ten receptor (np. cDNA lub plazmid).
- Uzyskaj materiał DNA, który wyraża domeny transbłonowe i wewnątrzkomórkowe mysiego łańcucha CD3ζ (np. cDNA lub plazmid).
- Zaprojektuj sekwencję białka fuzyjnego w oparciu o ogólną strukturę pokazaną na rysunku 1A. Upewnij się, że cała sekwencja znajduje się w tej samej ramce odczytu kodonu. Sekwencja ta służy do zaprojektowania odpowiednich starterów i weryfikacji produktu końcowego.
- Zaprojektuj dwie reakcje PCR, aby amplifikować każdy z fragmentów białek fuzyjnych osobno (Figura 1B, 1C).
nuta: Specyficzne warunki reakcji PCR (np. czas wydłużania i temperatura wyżarzania) zależą od charakteru starterów, które są przeznaczone dla określonego receptora.
- Wzmocnij zewnątrzkomórkowy segment receptora.
- Zaprojektuj starter 5', który zawiera część peptydu sygnałowego receptora, sekwencję konsensusu Kozaka i odpowiednie miejsce restrykcyjne (ryc. 1B).
- Zaprojektuj starter 3', który otacza obie części białka fuzyjnego (ryc. 1B). Na przykład, w początkowym projekcie, ten starter 3' może zawierać ostatnie 20 par zasad segmentu zewnątrzkomórkowego receptora i pierwsze 9 par zasad segmentu CD3ζ.
nuta: Nie ma potrzeby dodawania miejsca restrykcyjnego do startera 3', ponieważ ten starter będzie używany do generowania stopionej sekwencji i nie jest używany do ligacji.
- Wzmocnij segment CD3ζ.
- Zaprojektuj starter 5', który otacza obie części białka fuzyjnego (ryc. 1C). Na przykład, w początkowym projekcie, starter 5' może zawierać ostatnie 9 par zasad segmentu zewnątrzkomórkowego receptora i pierwsze 20 par zasad segmentu CD3ζ.
nuta: Nie ma potrzeby dodawania miejsca restrykcyjnego do startera 5', ponieważ ten starter będzie używany do generowania stopionej sekwencji i nie jest używany do ligacji.
- Zaprojektuj 3' starter, który zawiera koniec sekwencji CD3ζ, a także odpowiednie miejsce restrykcyjne (rysunek 1C).
- Skoryguj sekwencje starterów w każdej z tych dwóch reakcji tak, aby temperatura wyżarzania była podobna w każdej parze (należy zauważyć, że starter, który zawiera sekwencje dwóch części białka fuzyjnego, wyżarza się tylko z częścią sekwencji w każdej reakcji).
- Wykonaj dodatkowy PCR, w którym mieszanina produktów PCR pierwszych dwóch reakcji jest używana jako matryca DNA ze starterem 5' segmentu receptora zewnątrzkomórkowego (etap 1.4.1.1) i 3' segmentu CD3ζ (krok 1.4.2.2) (figura 1D). Ta reakcja powinna wygenerować końcową sekwencję fuzji.
- Postępuj jak zwykle w przypadku klonowania.
- Związać końcowy produkt PCR z docelowym wektorem cięcia (wektorem docelowym jest zwykle pcDNA3, który wyraża oporność na G418 i ampicylinę).
- Przekształć podwiązany wektor w kompetentną bakterię.
- Rozmrozić 50 μl kompetentnych bakterii na lodzie.
- Dodaj zligowany wektor do bakterii i inkubuj na lodzie przez 20 minut.
- Inkubować w temperaturze 42 °C przez 45 s.
- Dodaj 200 μl LB bez antybiotyków.
- Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, ciągle wytrząsając.
- Wysiewać nasiona na płytce LB z odpowiednimi antybiotykami (np. roztworem ampicyliny o końcowym stężeniu 0,1 mg/ml).
- Zbierz i wyhoduj kilka kolonii bakteryjnych w 5 ml LB (w probówkach 15 ml).
- Następnego dnia wyekstrahuj plazmidy za pomocą mini-zestawu przygotowawczego.
- Przeanalizuj wstawkę genu za pomocą enzymów restrykcyjnych.
- Zsekwencjonuj odpowiednie kolonie i sprawdź, czy sekwencja i ramka odczytu są prawidłowe (jak wskazano w kroku 1.3).
- Przekształć zweryfikowany plazmid w kompetentne bakterie.
- Rozmrozić 20 μl kompetentnych bakterii na lodzie.
- Dodać 1 μl plazmidu do bakterii i inkubować na lodzie przez 20 minut.
- Inkubować w temperaturze 42 °C przez 45 s.
- Dodaj 200 μl LB bez antybiotyków.
- Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, ciągle wytrząsając.
- Wysiew na płytce wzrostu bakterii z odpowiednimi antybiotykami (np. roztworem ampicyliny o końcowym stężeniu 0,1 mg/ml).
- Następnego dnia wyhoduj kolonię bakteryjną w dużym pojemniku LB z 0,1 mg / ml ampicyliny (~ 250 ml).
- Następnego dnia wykonaj maxi prep zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostarczonymi przez zestaw.
nuta: Do zabiegu elektroporacji wymagana jest duża ilość plazmidu, jak opisano poniżej.
2. Transfekcja plazmidu wyrażającego białko chimeryczne do komórek BW
UWAGA: Różne metody mogą być również stosowane do transfekcji (np. przez infekcję lentiwirusową). Przed elektroporacją należy przeprowadzić wytrącanie DNA etanolem, jak opisano poniżej. Kolejne kroki wymagają sterylnych warunków.
- Dzień wcześniej przygotuj ogniwa BW5147 ("ogniwa BW") do elektroporacji. Płytka 10 płytek (o długości 10 cm) z 10 ml 100 000 komórek/ml BW5147 (tj. łącznie 10 x 106 komórek) z RPMI uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 1% pirogronianem sodu, 1% L-glutaminą, 1% aminokwasami endogennymi i 1% penicyliną-streptomycyną ("kompletna pożywka").
- Umieść 100 μg plazmidu pcDNA3, który wyraża białko fuzyjne w probówce o pojemności 1,5-2 ml i dodaj do niego 3 M octan sodu o pH 5,3-5,5. Objętość octanu sodu powinna odpowiadać 0,1 (10%) objętości plazmidu o stężeniu 100 μg; miareczkować pH octanu sodu za pomocą pH-metru, dodając NaOH lub HCl.
- Dodać 2,5 objętości 100% etanolu do mieszaniny plazmidu i octanu sodu, jak opisano w kroku 2.2 (2,5x całkowita objętość plazmidu i octanu sodu). Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C lub przez 2 godziny w temperaturze 70 °C.
- 24 godziny po platerowaniu komórek BW zbierz wszystkie komórki BW (~100 ml) w 2 probówkach o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przez 5 minut przy 515 x g i odrzucić supernatant.
- Zawiesić osad z obu probówek w 25 ml RPMI- w pojedynczej probówce o pojemności 50 ml. Na przykład, ponownie zawiesić osad z jednej probówki z 25 ml RPMI, a następnie użyć tego płynu do ponownego zawieszenia płynu w drugiej probówce o pojemności 50 ml, tak aby całkowita osadka z komórek BW została ponownie zawieszona w 25 ml pożywki w jednej probówce.
nuta: Pożywka powinna być bez dodatków, ponieważ surowica może zakłócać elektroporację.
- Ponownie odwirować komórki przez 5 minut przy 515 x g. Ponownie zawiesić granulki w 1 ml RPMI i przenieść zawartość do kuwety o średnicy 0,4 cm na lodzie.
- Odwirować plazmid, który został poddany wytrącaniu etanolu (etap 2.3) przez 30 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C.
- Przemyć raz 1 ml 70% etanolu i odwirować przez kolejne 20 minut w temperaturze 16 000 x g i 4 °C (w celu wypłukania soli).
- Usunąć cały etanol i pozostawić osad do lekkiego wyschnięcia (tj. w otwartej probówce w kapturze do hodowli tkankowych). Zawiesić granulat ze 100 μL RPMI- uprzednio podgrzanym do 60 °C.
- Dodać ponownie zawieszony plazmid (krok 2.8) do komórek w kuwecie i inkubować przez 5 minut na lodzie.
- Elektroporuj ogniwa przy napięciu 0,23 kV, pojemności 250. Powinno to zająć ~4 ms.
- Przenieść elektroporowane ogniwa do probówki o pojemności 50 ml, dodać 50 ml kompletnej pożywki i wirować przez 5 minut przy 5,15 x g.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 ml kompletnej pożywki.
- Umieść elektroporowane komórki w 24-dołkowych szalkach hodowlanych (1 ml na studzienkę, w sumie ~50 dołków) i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.
- Wybrać transfekowane komórki antybiotykami. Po 48 godzinach dodać 1 ml kompletnej pożywki uzupełnionej 10 mg/ml G418 do każdej studzienki (na tym etapie końcowa objętość w każdym dołku wynosi 2 ml, a końcowe stężenie G418 w każdym dołku wynosi 5 mg/ml).
nuta: Jeśli plazmid zawiera inną oporność na antybiotyki, przed tym etapem określ stężenie antybiotyku wymagane do zabicia nietransfekowanych komórek BW.
- Co 48 godzin ostrożnie wyrzucaj 1 ml górnej objętości każdej studzienki, nie mieszając pożywki w studzience (komórki BW zwykle znajdują się na dnie studzienki). Dodać kompletną pożywkę uzupełnioną 5 mg/ml G418 do każdej studzienki, tak aby końcowa objętość w każdym dołku wynosiła ponownie 2 ml.
- Regularnie badaj płytki hodowlane pod kątem wzrostu komórek we wszystkich studzienkach.
nuta: Zmiana koloru podłoża na żółty może pomóc w identyfikacji rosnących komórek; jednak na początku medium będzie żółte ze względu na sam G418. Zidentyfikuj dodatnie dołki (studzienki z rosnącymi komórkami). Studzienki te są odporne na G418 i dlatego oczekuje się, że będą wyrażać białko fuzyjne. Proces ten trwa zwykle ~3 tygodnie.
3. Weryfikacja ekspresji transfekowanego receptora w komórkach w dołkach dodatnich.
- Wybarwić transfekowane komórki BW specyficznym przeciwciałem przeciwko receptorowi, który został transfekowany.
- Porównaj poziom ekspresji receptora za pomocą cytometrii przepływowej z ekspresją komórek kontrolnych (nietransfekowane komórki BW).
- Po weryfikacji jednego lub więcej studzienek należy natychmiast użyć komórek do celów eksperymentalnych, wyhodować je w kulturze lub zamrozić do przyszłych zastosowań.
- Sprawdź ekspresję transfekowanego receptora przed wykonaniem nowego eksperymentu. Po kilku tygodniach wzrostu komórki z G418 o stabilnej ekspresji receptora, G418, można pominąć w pożywce hodowlanej.
4. Inkubacja transfekowanych komórek BW z celami
UWAGA: Gdy po raz pierwszy używa się transfekowanych komórek BW, lepiej jest przetestować je na celach, które wyrażają znany ligand interesującego nas receptora lub na przeciwciałach związanych z płytką specjalnie skierowanych przeciwko receptorowi będącemu przedmiotem zainteresowania (eksperymenty sieciowania; patrz poniżej, sekcja 4.2.1.3).
- Najlepiej podzielić komórki BW na 24 godziny przed eksperymentem (na przykład dodając 10 ml kompletnej pożywki do 2 ml komórek w hodowli na nowej 10 cm płytce hodowlanej).
- Inkubować transfekowane komórki BW z ich celami. Przeprowadź eksperyment jednocześnie na kontrolnych komórkach BW, które wyrażają pusty wektor (lub rodzicielskie komórki BW). Preferowane są płyty 96F (ale można również użyć płyt 96U). Wykonaj eksperyment w trzech egzemplarzach. Zawieś wszystkie komórki w kompletnym podłożu.
- Przygotuj cele. Typ celu zmienia się w zależności od celu i mogą to być komórki, komórki, które zostały wstępnie inkubowane z przeciwciałami lub same przeciwciała. System ten był również używany z bakteriami jako celami.
- Jeśli cele dzielą komórki (tj. Linie komórkowe), napromieniuj je prądem 6,000 rad przed testem. Umieścić 50 000 komórek docelowych w jednym dołku na 96 płytkach (w objętości 100 μl).
- W przypadku eksperymentów z przeciwciałami i komórkami BW, które wyrażają ludzkie FcγR, należy inkubować komórki docelowe z przeciwciałem na lodzie na 96-dołkowej płytce (na przykład 50 μl komórek docelowych i 50 μl przeciwciała; można testować różne dawki przeciwciał).
- W przypadku stosowania samych przeciwciał jako celów (eksperymenty z sieciowaniem), powinny one być związane z płytką. W tym celu należy najpierw inkubować przeciwciała w kompletnym podłożu na płytce 96F przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (typowa dawka początkowa to 0,5 μg swoistego przeciwciała w 50 μL). Umyć płytkę w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.
nuta: W tym przypadku płytka 96F umożliwi związanie przeciwciała z płytką, co po dodaniu transfekowanych komórek BW doprowadzi do aktywacji transfekowanego receptora.
- Dodaj komórki BW (komórki efektorowe). Umieść 50 000 komórek BW w jednym dołku na 96 płytkach (w objętości 100 μl).
- W razie potrzeby uzupełnić objętość w każdym studzience do 200 μl.
- Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin (ten czas można skalibrować).
- Po 48 godzinach zamrozić płytki w temperaturze -20°C i rozmrozić je przed testem ELISA lub natychmiast użyć ich do testu ELISA (patrz następne kroki).
5. TEST ELISA
- Pokryj płytkę ELISA przeciwciałem anty-mysim IL-2 (anty-mIL-2). Umieścić 0,05 μg anty-mIL-2 w objętości 50 μL 1x PBS (sól fizjologiczna z buforu fosforanowego) na studzienkę. Inkubować powlekaną płytkę ELISA z przeciwciałem anty-mIL-2 w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze 37 °C przez 2 godziny
nuta: Aby przeprowadzić test ELISA bezpośrednio po etapie inkubacji, płytkę ELISA należy pokryć na 24 godziny przed końcem okresu inkubacji komórek BW.
- Wyrzucić płyn z płytki ELISA i dodać roztwór blokujący (200 μl na studzienkę), który składa się z 1x PBS i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Inkubować płytkę ELISA przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Umyj płytkę ELISA trzykrotnie 0,05% roztworem PBS Tween (tj. 0,5 ml Tween-20 w 1 litrze 1x PBS).
- Wziąć płytkę 96, na której znajdują się komórki BW, które były inkubowane ze swoimi tarczami (4.3). Jeżeli płytka została zamrożona, należy ją całkowicie rozmrozić (np. przez krótką inkubację w temperaturze 37 °C). Odwirować 96-dołkową płytkę (5 min, 515 x g) i ostrożnie przenieść 100 μl supernatantu z każdej studzienki na wstępnie pokrytą i zablokowaną płytkę ELISA.
nuta: Supernatant powinien być pobrany z boków każdej studzienki, aby uniknąć pobierania komórek.
- W razie potrzeby dodaj rekombinowany mIL-2 o określonych stężeniach do jednego z pustych rzędów powlekanej płytki ELISA, aby wygenerować standardową krzywą mIL-2. Na przykład zacznij od stężenia mIL-2 wynoszącego 2,500 pg/ml, a następnie zmniejsz o 50% w każdym kolejnym dołku; nie dodawać mIL-2 do ostatniej studzienki.
- Inkubować płytkę ELISA w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
- Umyj płytkę ELISA czterokrotnie za pomocą PBS Tween.
- Dodaj biotynę anty-mysią IL-2 do płytki ELISA. Użyj stężenia 1 μg przeciwciała w 1 ml 1x PBS z 1% BSA i podziel na 100 μl na studzienkę.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Umyj płytkę ELISA sześć razy za pomocą PBS Tween.
- Dodać streptawidynę sprzężoną z HRP. Użyj stężenia 1 μl streptawidyny w 1 ml PBSX1 z 1% BSA i podziel je na 100 μl na studzienkę.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Umyj płytkę ELISA sześć razy za pomocą PBS Tween.
- Dodać 100 μl roztworu substratu TMB na studzienkę. Zakończ ten etap szybko, aby zminimalizować różnice między studzienkami spowodowane opóźnieniami podczas dodawania TMB.
- Odczytaj płytkę ELISA za pomocą czytnika płytek ELISA przy 650 nm (odczyt można powtórzyć, jeśli sygnał jest słaby).
