$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Oczyszczanie GTPazy oznaczonej GST
- Hodowla szczepu E. coli, takiego jak BL21 przekształconego za pomocą pGEX-Rac1 O/N w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 220 obr./min, w 500 ml pożywki autoindukcyjnej (25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,5% glicerol, 0,05% glukozy, 0,2% laktozy, 5 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 100 μg/ml ampicyliny).
- Zebrać bakterie przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g, 4 °C.
- Zawiesić osad bakteryjny w 20 ml odczynnika do ekstrakcji białek, 1x inhibitora proteazy i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej z inwersją.
- Klarować lizat przez odwirowanie w stężeniu 40 000 x g przez 30 minut.
- Dodać 2 ml kulek magnetycznych glutationu, przemytych solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS: 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Inkubować przez 2 godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze 4 °C.
- Umyj kulki naładowane białkiem cztery razy za pomocą 10 ml PBS, używając magnetycznego sortownika cząstek, aby wytrącić kulki na każdym etapie.
- Zawiesić kulki białkowe w 2 ml PBS i przechowywać w temperaturze -80 °C w 100 μl porcji, aż będą potrzebne.
2. Ekspresja białek wiążących GTPazę
- Dzień przed eksperymentem, transfekcyjne plazmidy kodujące wersje każdego białka wiążącego GTPazę znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w oddzielnej kolbie o długości 75cm2 z HEK293T w następujący sposób. W celu walidacji obciążenia nukleotydami, transfekcję TrioD1 znakowaną GFP należy umieścić w trzeciej kolbie o długości75 cm2 z HEK293T.
- Rozcieńczyć polietylenoaminę do 1 mg/ml w 100 μl sterylnego 150 mM NaCl.
- Dodać 27 μl rozcieńczonego polietylenu do 223 μl zredukowanej pożywki surowicy.
- Dodać 12 μg plazmidowego DNA do 250 μl zredukowanej pożywki surowicy.
- Inkubować każdą probówkę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
- Połącz mieszaniny polietylenoaminy i DNA w jednej probówce i wiruj przez 2 minuty.
- Inkubować przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
- Zastąp pożywkę wzrostową (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, bez antybiotyków) na 90% zlewającą się HEK293T 5 ml świeżej pożywki wzrostowej.
- Dodać połączoną mieszaninę polietylenu i DNA do kolby i inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
3. Oczyszczanie białek wiążących GTPazę
- Przepłukać kolby z transfekowanymi komórkami w PBS i opróżnić kolbę przez 5 minut, zasysając wolny płyn.
- Zeskrob komórki z 500 μl buforu do lizy (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x inhibitor proteazy) do probówki do mikrofuge.
- Lizować komórki przez mieszanie przez odwrócenie w temperaturze 4 °C przez 30 min.
- Podczas lizy umyć dwie partie kulek GFP-Trap o pojemności 40 μl trzykrotnie świeżym buforem do lizy, kulkami osadowymi w ilości 2 700 x g przez 2 minuty między myciami.
- Klarować lizaty przez odwirowanie przy 21 000 x g przez 10 min.
- Przenieść oczyszczony lizat każdego z konkurencyjnych białek do oddzielnych przemytych kulek pułapki GFP i pozwolić białkom fuzyjnym GFP związać się przez 2 godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze 4 °C. Lizat z komórek GFP-TrioD1 należy przechowywać na lodzie.
- Załadowane kulki GFP-Trap umyć dwukrotnie w 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w/v) Nonidet P-40 i dwukrotnie w 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2, kulkach sedymentacyjnych przy 2 700 x g przez 2 minuty między praniami.
- Elute białka fuzyjne GFP poprzez dodanie 40 μl 0,2 M glicyny (pH 2,5) i pipetowanie w górę iw dół przez 30 sekund. Natychmiast zderzyć osad przy 21 000 x g przez 60 s i przenieść ciecz do nowej probówki do mikrofuzy zawierającej 4 μl 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Zrób to szybko, aby ograniczyć uszkodzenia oczyszczonego białka.
- Przeanalizować 1 μl każdego oczyszczonego białka metodą Western blot i sondować przeciwciałem anty-GFP w celu ustalenia względnej wydajności przy użyciu ilościowego systemu blottingu zgodnie z protokołem producenta. Alternatywnie, można określić stężenia białek za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA), ale wprowadza to błędy, jeśli białka nie reagują z testem w identyczny sposób lub jeśli występują białka zanieczyszczające.
- Wyrównaj stężenie białka molowego przez dodanie 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) i 20 mM MgCl2.
4. Obciążenie nukleotydami GTPazy
- Rozmrozić jedną porcję koralików magnetycznych GST-Rac1 przygotowanych w kroku 1.
- Weź 90 μl kulek GST-Rac1 i przemyj trzykrotnie 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT i 4 mM EDTA, używając sortera cząstek magnetycznych do wytrącenia kulek na każdym etapie.
- Odessać bufor z kulek i dodać 100 μl 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT i 4 mM EDTA.
- W zależności od tego, czy w eksperymencie konkursowym wymagane jest obciążenie GDP, GTP, czy nie jest wymagane żadne obciążenie nukleotydami, dodaj 12 μl 100 mM GDP, 12 μl 10 mM guanozyno-5'-[γ-tio]trifosforanu (GTPγS) lub brak nukleotydu do 60 μl kulek GST-Rac1.
- W przypadku kontroli obciążenia nukleotydami podziel pozostałe kulki na trzy podwielokrotności 10 μl i dodaj 2 μl 100 mM GDP, 2 μl 10 mM GTPγS lub bez nukleotydu do każdej probówki.
- Inkubować mieszanki kulkowe przez 30 minut w temperaturze 30 °C z mieszaniem.
- Ustabilizować Rac1 związany z nukleotydami przez dodanie 1 M MgCl2: 3 μl do mieszaniny doświadczalnej (etap 4.4) i 0,5 μl do każdej z mieszanin kontrolnych (krok 4.5).
5. Wiążące zawody
- Ustaw 6 probówek do mikrofuge, z których każda zawiera:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl eksperymentalnych kulek Rac1 załadowanych nukleotydami (od kroku 4.7)
5 μl białka wiążącego Rac1 A (stałe białko wiążące)
- Do każdej probówki dodać 0, 1, 2,5, 5, 10 lub 20 μl białka B wiążącego Rac1 (białko o zmiennym wiązaniu). Objętości te zakładają w przybliżeniu równe stężenia stałych i zmiennych białek wiążących i mogą wymagać dostosowania.
- Dostosuj objętości białek wiążących A i B, jeśli występują duże różnice w powinowactwie wiązania dwóch białek i powinno to być określone empirycznie za pomocą powtórzeń doświadczalnych. Uzupełnić całkowitą objętość mieszaniny wiążącej do 235 μl przez dodanie 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) i 20 mM MgCl2.
- Zainstaluj probówkę do mikrofuge zawierającą:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl eksperymentalnych kulek Rac1 załadowanych nukleotydami (od kroku 4.7)
10 μl białka A wiążącego Rac1 (białko o stałym pasie)
- Ustaw probówki kontrolne GDP, GTPγS i bez nukleotydów:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl kontrolnych kulek Rac1 załadowanych w kroku 4.5 z GDP, GTPγS lub bez nukleotydu i ustabilizowanych w kroku 4.7.
180 μl lizatu HEK293T GFP-TrioD1, przygotowanego jak w kroku 3.6
4 μl 1 M MgCl2
- Inkubować mieszaninę przez 2 godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze 4 °C.
- Umyj kulki trzykrotnie 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) i 20 mM MgCl2.
- Elute białka związane w 20 μl redukującego buforu próbki (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glicerol, 0,02 mg/ml błękitu bromofenolowego, 5% β-merkaptoetanolu).