Test mikromacierzy antygenu wirusowego do wykrywania izotypów przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi wirusowemu

Streszczenie

Źródło: Khan, S., et al., Użycie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w podtypach wirusa. J. Vis. Exp. (2019)

W tym filmie pokazujemy proces wykrywania izotypów przeciwciał w wielu próbkach ludzkiej surowicy za pomocą szkiełka mikromatrycowego wydrukowanego z antygenowymi podtypami szczepów wirusa grypy.

Protokół

1. Wyprodukuj mikromatryce antygenów grypy

1. Drukowanie antygenów na szkiełkach mikromacierzowych
   1. Rozpuść każdy liofilizowany antygen do stężenia 0,1 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) z 0,001% Tween-20 (T-PBS). Przenieść 10 μl każdego odtworzonego antygenu do indywidualnych studzienek na niepoddanej działaniu 384-dołkowej płytki o płaskim dnie.
   2. Drukowanie antygenów za pomocą drukarki mikromatrycowej z niskonakładowymi szkiełkami do mikromatryc, które zasysają antygen do kanału próbki i osadzają go poprzez bezpośredni kontakt i działanie kapilarne na 16-punktowych szkiełkach szklanych pokrytych nitrocelulozą.
      1. Zaprogramuj oprogramowanie drukujące (np. Gridder) z konfiguracją płyty źródłowej i parametrami drukowania.
         1. Użyj menu rozwijanego, aby wybrać nazwę typu płyty, która będzie używana w tej metodzie drukowania. Do tego badania użyj niepoddanej obróbce 384-dołkowej płytki o płaskim dnie.
         2. Zaznacz pole tekstowe obok opcji Liczba płyt i wpisz liczbę płyt próbnych, które będą używane w tym protokole drukowania. Do tego badania użyj 1 płytki.
         3. Wybierz konfigurację pinów, która ma być używana z tą metodą. Do tego badania użyj konfiguracji 8-pinowej.
         4. Upewnij się, że przesunięcia początku to odległości (w kierunkach X i Y) między punktem początkowym slajdu (który jest skalibrowany w sekcji Administracyjne) a miejscem, w którym kołki drukowania rozpoczną drukowanie na slajdach.
         5. Korzystając z karty Projekt tablicy, zdefiniuj rozmiar i kształt tablic (odstępy między kropkami i liczba punktów w podtablicy). Na potrzeby tego badania wydrukuj 324 plamki (średnica 180 μm z odstępem 300 μm) na 16-padowych szkiełkach w formacie 18x18 za pomocą 8 pinów.
         6. Wybierz parametry określające, w jaki sposób kołki drukujące pobierają i dozują próbki. W tym badaniu każdy szpilka zasysa 250 nL roztworu antygenu i drukuje 1 nL na każdym z 40 punktów (w sumie 20 szkiełek dla wszystkich 8 pinów)
         7. Skonfiguruj protokół czyszczenia pinów i protokół blottingu. W tym badaniu każdy antygen z nadrukiem szpilki jest zanurzany w sterylnym ddH₂O w sonikowanym pojemniku do mycia, a następnie odsysany następny antygen.
         8. Określ kolejność, w jakiej bloki próbki są drukowane na slajdach. Oprogramowanie macierzy skonstruuje plik z adnotowanym indeksem siatki (.gal) w celu opisania rozmieszczenia antygenów w każdej mikrotablicy.
            nuta: Górny rząd jest używany dla powierników (z fluorescencją na wszystkich długościach fal stosowanych w obrazowaniu, np. mieszanina koniugatu streptawidyny Qdot 585 nm i koniugatu streptawidyny Qdot 800 nm w tym badaniu) do orientowania siatek podczas obrazowania. W przypadku długich nakładów antygeny na płycie źródłowej mogą być okresowo ponownie zawieszane przez pipetowanie w górę i w dół, a następnie wirowanie, lub można przygotować i użyć nowej płytki źródłowej.
   3. Umieść niesondowane szkiełka do mikromacierzy w światłoodpornym pudełku i przechowuj je w szafce eksykatora w temperaturze pokojowej do długotrwałego przechowywania.
      nuta: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany na czas nieokreślony.
2. Przeprowadzanie kontroli jakości (wymaga znaczników polihistydynowych)
   1. Przymocować szkiełko do komór pomiarowych i ponownie uwodnić za pomocą buforu blokującego, jak opisano w krokach 2.1.1-2.1.2 i pokazano na rysunku 1.
   2. Rozcieńczyć mysie przeciwciało monoklonalne poli-His w stosunku 1:100 w przefiltrowanym buforze blokującym 1x.
      nuta: Jeżeli nieoczyszczone antygeny białkowe (np. wyrażane w systemie transkrypcji i translacji in vitro) są bezpośrednio używane do drukowania mikromacierzy, należy dodać składniki systemu ekspresji białek (np. lizat E. coli) w stosunku 1:10 z buforem blokującym używanym do rozcieńczania surowicy w celu zablokowania wszelkich przeciwciał skierowanych przeciwko tym składnikom.
   3. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała poli-He do każdej komory szkiełkowej zawierającej podkładkę do matrycy po aspiracji i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. Umyj 3x buforem T-TBS zgodnie z opisem w kroku 2.2.1. Rozcieńczyć sprzężone z biotyną kozie przeciwciało anty-mysie IgG w stosunku 1:200 w buforze blokującym, dodać 100 μl na basenik po aspiracji i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Mycie 3x za pomocą bufora T-TBS.
   4. Rozcieńczyć koniugat streptawidyny Qdot 585 nm do 4 nM w buforze blokującym, dodać 100 μl na basenik po aspiracji i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Umyj 3x buforem T-TBS, a następnie raz buforem TBS (bez Tween).
   5. Demontaż i kwantyfikacja slajdów zgodnie z opisem w krokach 2.2.5 – 3.1.2.
      nuta: Antygeny białkowe muszą zawierać znaczniki His10, aby można było korzystać z tego protokołu kontroli jakości. Alternatywnie, jeśli dołączony jest inny znacznik, można przeprowadzić kontrolę jakości za pomocą przeciwciała lub liganda dla tego znacznika.

2. Surowice pomiarowe na obecność przeciwciał przeciwko grypie za pomocą mikromacierzy

1. Inkubować surowice na mikromacierzach w celu wiązania przeciwciał.
   1. Przymocuj szkiełka mikromacierzy do komór za pomocą klipsów i umieść je w ramkach, jak pokazano na rysunku 2.
      nuta: Zawsze unikaj dotykania podkładki mikromacierzy rękami i instrumentami. Upewnij się, że prowadnice są ustawione stroną z podkładką do góry i małym wycięciem w prawym górnym rogu.
   2. Ponownie uwodnić szkiełka mikromacierzy ze 100 μl na studzienkę przefiltrowanego 1x buforu blokującego i rozcieńczyć surowicę 1:100 w 100 μl buforu blokującego (można użyć nietraktowanych płytek 96-dołkowych lub probówek 2 ml). Inkubować zarówno uwodnione szkiełka mikromacierzy w zakrytych ramkach, jak i rozcieńczone surowice oddzielnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100-250 obr./min. Wszystkie kolejne etapy inkubacji należy wykonać podobnie na wytrząsarce.
      nuta: Surowice należy podsycić i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania, aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, a przed użyciem należy je zawirować w celu wymieszania i odwirować w celu usunięcia cząstek stałych. Uważnie obserwuj komory suwakowe podczas i po tym etapie, aby wykryć wszelkie wycieki, które wymagają ponownego montażu komór suwakowych.
   3. Używając końcówek do pipet podłączonych do przewodu próżniowego z wtórną kolbą zbiorczą, ostrożnie zassać bufor blokujący z rogu każdej komory, nie dotykając elektrod. Wszystkie kolejne kroki aspiracji należy wykonywać podobnie. Rozcieńczone surowice dodać do podpasek szybko po aspiracji, aby nie dopuścić do wyschnięcia podpasek.
   4. Umieść przykryte ramki na tacach w dodatkowym pojemniku otoczonym wilgotnymi ręcznikami papierowymi i szczelnie zamkniętymi, aby zapobiec parowaniu. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce kołyszącej (alternatywnie można inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100-250 obr./min).
2. Znakowane przeciwciała surowicy związane z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z kropkami kwantowymi
   1. Ostrożnie odessać surowice z komór, jak opisano powyżej, dodać 100 μl buforu T-TBS na studzienkę (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 w ddH₂O dostosowanym do pH 7,5 i przefiltrowanym, można uzyskać komercyjnie) i inkubować przez 5 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100-250 obr./min. Powtórz ten krok prania w sumie 3 razy (wszystkie kolejne kroki prania są wykonywane podobnie).
   2. Przygotować mieszaninę przeciwciał drugorzędowych rozcieńczoną do 1 μM w buforze blokującym i dokładnie wymieszać pipetując przed użyciem i w jego trakcie, aby zachować jednorodność.
      nuta: Aby zachować odtwarzalność testu, ta sama partia każdego przeciwciała drugorzędowego powinna być używana do wszystkich eksperymentów sondujących, dla których planowane jest ilościowe porównanie danych z różnych doświadczeń. Specyficzne stężenie przeciwciała drugorzędowego może wymagać zmiany w zależności od powinowactwa; Postępuj zgodnie z protokołami producenta, jeśli są dostępne.
   3. Po końcowym płukaniu odessać bufor z komór, dodać 100 μl do studzienki mieszaniny przeciwciał wtórnych i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
   4. Odessać mieszaninę przeciwciał wtórnych przemyć 3x buforem T-TBS, a następnie przemyć raz buforem TBS (bez Tween).
   5. Ostrożnie zdemontuj szkiełka do mikromatrycy z komór, aby nie dotykać podkładek, delikatnie spłucz przefiltrowanym ddH₂O i wysusz, umieszczając je w probówkach o pojemności 50 ml i odwirowując przy 500 x g przez 10 minut.
   6. Umieść szkiełka z sondą mikromacierzy w światłoszczelnym pudełku i przechowuj je w szafie eksykatora w temperaturze pokojowej do długotrwałego przechowywania.
      nuta: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany na okres do 1 tygodnia.

3. Ilościowe określenie wiązania przeciwciał z antygenami w mikromacierzy

1. Wizualizacja szkiełek z mikromacierzy i ilościowe określenie intensywności fluorescencji punktowej w celu pomiaru wiązania przeciwciał.
   1. Pozyskiwanie obrazów preparatów z mikromacierzą za pomocą przenośnego imagera z wbudowanym oprogramowaniem.
      1. Na karcie Configure Imager (Konfiguruj imager) wybierz odpowiednią konfigurację slajdu. Do tego badania użyj szkiełek z 16 padami.
      2. Na karcie Image Control wybierz odpowiedni kanał fluorescencyjny i dostosuj wzmocnienie, czas ekspozycji i czas akwizycji w zależności od reaktywności surowicy, aby uzyskać optymalne obrazy. W tym badaniu kanały fluorescencyjne dla IgA i IgG wynosiły odpowiednio 585 nm i 800 nm, a ustawienia obrazowania to wzmocnienie 50, czas ekspozycji 500 ms i czas akwizycji 1 s.
      3. Kliknij Przechwyć, aby rozpocząć proces pobierania obrazu.
         nuta: Preparaty z mikromacierzą mogą być ponownie obrazowane przy wielu ustawieniach bez degradacji sygnałów, o ile są przechowywane w ciemności i suchości. Można stosować inne systemy obrazowania, jeśli są kompatybilne ze szkiełkami.
2. Wykrywaj plamki w tablicy za pomocą siatek zorientowanych na podstawie znaczników odniesienia i mierz intensywność plamki jako medianę intensywności pikseli pomniejszoną o tło mierzone wokół plam. Wykonaj ten algorytm kwantyfikacji w partiach za pomocą wbudowanego oprogramowania imager, które wykorzystuje plik .gal skonstruowany w kroku 1.1.2 do łączenia intensywności plamki z poszczególnymi antygenami na każdej mikromacierzy.
   1. W panelu Informacje o pliku prześlij plik .gal, wybierając go z folderu na komputerze, a następnie w sekcji Opcje analizy określ folder, w którym mają zostać zapisane pliki wyjściowe analizy.
   2. Na karcie Image Control (Kontrola obrazu) otwórz jeden z pobranych obrazów, które mają zostać określone ilościowo, i wybierz przycisk Auto w prawym górnym rogu.
   3. W sekcji Array Analysis (Analiza tablicy) w prawym dolnym rogu utwórz szablon odniesienia zgodnie z instrukcjami oprogramowania.
   4. Kliknij Analiza wsadowa, wybierz folder zawierający obrazy do określenia ilościowego, a następnie wybierz szablon odniesienia, który został utworzony w poprzednim kroku. Oprogramowanie analizuje każdy obraz i określa ilościowo intensywność plamki.
      nuta: Ten krok spowoduje wygenerowanie pliku .csv zawierającego intensywność punktową określającą ilościowo przeciwciała w każdej próbce surowicy, które wiążą się z każdym pojedynczym antygenem w mikromacierzy, które można następnie manipulować w oprogramowaniu do manipulacji lub analizy arkuszy kalkulacyjnych.
3. Analizuj surowe dane, aby porównać wiązanie przeciwciał między antygenami i próbkami surowicy. W tym badaniu przeciwciała IgA i IgG mierzone jako intensywność plamki fluorescencyjnej 585 nm i 800 nm porównano we wszystkich antygenach między 2 niezależnymi seriami eksperymentu przy użyciu różnych szkiełek w różnych dniach, a następnie przeprowadzono analizę korelacji w celu zmierzenia odtwarzalności testu.
   nuta: W przypadku nieoczyszczonych białek drukowanych jako mieszanina ekspresyjna, analizę danych należy rozpocząć od odjęcia tła bez kontroli DNA.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat protokołu drukowania i sondowania mikromacierzy antygenu grypy. Od lewej do prawej, mikromacierz jest drukowana za pomocą szkiełek pokrytych nitrocelulozą, które są używane do sondowania surowic na obecność przeciwciał IgG i IgA za pomocą przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z kropkami kwantowymi, ze szkiełkami obrazowanymi za pomocą przenośnego imagera, a wynik...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16-padowe pokryte nitrocelulozą	Grace Bio Labs	305016
1x GVS FAST	Fischer Scientific	10485356
ArrayCam	Grace Bio Labs	400S	Inne urządzenia do obrazowania mogą być używane do wizualizacji slajdów, jeśli są w stanie osiągnąć rozdzielczość plamek mikromacierzy oraz długości fal wzbudzenia i emisji kropek kwantowych.
kozie przeciwciało anty-mysie-IgG sprzężone z biotyną	Thermo Fischer	31800
płytka HiBase 384-dołkowa	Greiner Bio-One	T-3037-11
piny do mikromacierzy	ArrayIt	GMP2	Każda inna drukarka mikromacierzy może wymagać własnych niestandardowych pinów mikromacierzy.
Mysie przeciwciało monoklonalne poli-He	Sigma-Aldrich	H1029
OmniGrid 100	GeneMachines		Wersja drukarki mikrotablicowej użyta w tej pracy nie jest już dostępna na rynku, ale zaktualizowanym podobnym sprzętem jest drukarka mikrotablicowa OmniGrid Accent firmy Digilab (Hopkinton, MA), a ten sam protokół można zastosować z większością dostępnych na rynku drukarek mikrotablicowych.
ProPlate	Grace Bio Labs	246890
ProPlate	Grace Bio Labs	204838
ProPlate	Grace Bio Labs	246879
Quantum dot 585 nm sprzężone kozie przeciwciało anty-ludzkie-IgA	Grace Bio Labs	110620
Kropka kwantowa 585 nm koniugat streptawidyny	Thermo Fischer	Q10111MP
Quantum dot 800 nm sprzężone kozie przeciwciało anty-ludzkie-IgG	Grace Bio Labs	110610