Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wstępne rozmieszczenie zwierząt
- Zważ mysz i załaduj odpowiedni lek (np. kannabinoid, 5 mg/kg masy ciała (m.c.)) do strzykawki insulinowej. Lek należy podać 30 minut przed indukcją skrzepliny.
- Trzymając szyję myszy między kciukiem a palcem wskazującym, a ogon myszy małym palcem, rozciągnij zwierzę i wstrzyknij lek dootrzewnowo (ip) w lewy dolny kwadrant brzucha. Włóż zwierzę z powrotem do klatki na 15 minut.
- Przygotuj znieczulenie ketaminą (90 mg/kg m.c.) i ksylazyną (25 mg/kg m.c.). 15 minut przed indukcją skrzepliny znieczulij mysz. Umieść mysz w klatce, lekko pociągnij za ogon i wstrzyknij środki znieczulające za pomocą strzykawki insulinowej.
- Włóż mysz z powrotem do klatki do momentu rozpoczęcia znieczulenia. Aby sprawdzić, czy znieczulenie jest wystarczające, uszczypnij ogon kleszczami.
- Załadować 0,05 ml rozmrożonego dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (dekstran FITC; 5%, 150 kDa) do strzykawki insulinowej. Podczas napełniania strzykawki należy upewnić się, że nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza, ponieważ nawet małe pęcherzyki powietrza podawane dożylnie mogą być śmiertelne dla zwierzęcia.
- Umieść znieczuloną mysz na płycie grzewczej w pozycji zadrukowaną do dołu. Ustawić płytę grzewczą na 37 °C.
- Nałóż maść na oko na rogówkę myszy. Zdezynfekuj skórę i używaj sterylnych narzędzi.
- Zszyj dwa szwy z polipropylenu 7/0 w krawędź czaszki i ogona prawego ucha. Umieść ściegi jak najbliżej krawędzi i jak najbliżej podstawy (Rysunek 1B).
- Przesuń mysz do pozycji grzbietowej. Przymocuj wszystkie nogi do platformy ze szkła akrylowego za pomocą pasków samoprzylepnych. Zaczepić szew pod przednimi zębami i ustawić głowę w zgięciu grzbietowym, przyklejając szew do szkła akrylowego za pomocą pasków samoprzylepnych.
- Przenieś zwierzę na platformę pod stereoskopowym mikroskopem operacyjnym. Użyj 16-krotnego powiększenia.
2. Przygotowanie lewej żyły szyjnej i wstrzyknięcie FITC-Dekstranu
Uwaga: Do mikroskopii prawego ucha przygotuj lewą żyłę szyjną.
- Za pomocą skalpela wykonaj 5-milimetrowe nacięcie w skórze po lewej stronie szyi w kierunku czaszkowo-ogonowym. Wypreparuj tkankę podskórną za pomocą mikrokleszczy i mikronożyczek. Podwiązywać naczynia krzyżowe za pomocą szwów poliestrowych 8/0 lub z elektrokoagulacją.
- Uwolnij żyłę z przydanki za pomocą mikrokleszczyków i mikronożyczek bez dotykania naczynia.
- Do wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego należy użyć przygotowanej strzykawki insulinowej. Ostrożnie chwyć ścianę naczynia mikrokleszkami, nie perforując żyły. Przeniknąć strzykawką do rozdętej ściany naczynia i wstrzyknąć FITC-dekstran dożylnie.
- Krwawienie należy zatamować po wyjęciu strzykawki za pomocą bawełnianych wacików. Unikaj zanieczyszczenia ucha krwią i barwnikiem.
3. Umiejscowienie prawego ucha w przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej
- Przenieś zwierzę na płycie grzewczej do konstrukcji ze szkła akrylowego ze szczeliną na płytę grzewczą i płaszczyzną o wysokości 0,5 cm do ustawienia ucha.
- Przymocuj zwierzę twarzą do dołu na płycie grzewczej za pomocą pasków samoprzylepnych. Umieść stosunkowo mocną i wypukłą chrząstkę u podstawy ucha obok płaszczyzn ucha o wysokości 0,5 cm (ryc. 1B), tak aby wierzchołkowa część ucha mogła być umieszczona płasko na płaszczyźnie.
- Dodaj jedną kroplę 0,9% NaCl o temperaturze pokojowej do płaszczyzny szkła akrylowego, aby ustawić ucho. Umieść prawe ucho, z wstępnie ułożonymi szwami na jego wklęsłej stronie brzusznej skierowanej w dół, na kropli 0,9% NaCl. Za pomocą bawełnianych wacików zaabsorbuj kroplę NaCl i pozwól, aby siły kapilarne przymocowały płaszczyznę ucha do szkła akrylowego.
- Przyklej szwy do szkła akrylowego, aby ustalić pozycję ucha.
- Dodaj jedną kroplę 0,9% NaCl o temperaturze pokojowej do wypukłej grzbietowej strony ucha. Ostrożnie przyłóż jedno szkiełko nakrywkowe (o średnicy 0,5 cm) do ucha, nie uciskając naczyń podstawowych wchodzących do ucha. Za pomocą bawełnianych wacików usuń jak najwięcej NaCl spod szkiełka nakrywkowego, aby zminimalizować odległość między szkiełkiem nakrywkowym a naczyniami docelowymi ucha.
4. Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej i indukcja skrzepliny w prawym uchu
- Dostosuj przyżyciowy mikroskop fluorescencyjny do wizualizacji FITC-dekstranu (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Użyj zmiennej lampy rtęciowej o mocy 100 W jako źródła światła. Podłącz czarno-białą kamerę CCD o wysokiej rozdzielczości do nagrywarki DVD.
- Przenieś zwierzę na szkle akrylowym zawierającym płytkę grzewczą ze stałym odwodzonym uchem na biurko przyżyciowego mikroskopu fluorescencyjnego.
- Korzystając z 20-krotnego powiększenia (apertura numeryczna 20x/0,95) i 20% natężenia światła, wyszukaj naczynie żylne o średnicy 50 - 60 μm i następczym przepływie krwi 400 - 600 μm/s.
- Dodaj jedną kroplę wody o temperaturze pokojowej do szkiełka nakrywkowego, aby zanurzyć się w wodzie obiektywu o powiększeniu 63x (apertura numeryczna 63x/0,95). Użyj strzykawki z kaniulą o średnicy 1 mm i umieść kroplę na obiektywie mikroskopu. Dodaj tyle wody, aby zetknęło się z szkiełkiem nakrywkowym i obiektywem z kroplą wody.
- Natychmiast po nałożeniu kropli wody rozpocznij nagrywanie naczynia przez 20 s przy 20% natężeniu światła w celu pomiaru średnicy i przepływu krwi w trybie offline.
- Indukcję skrzepliny należy rozpocząć 5 minut po wstrzyknięciu FITC-dextranu. W tym celu należy zwiększyć natężenie światła do 100%.
- Podczas indukcji skrzepliny zamknij otwór mikroskopu na 2 sekundy w ciągu 30 sekund, aby sprawdzić przepływ krwi. W przypadku utrzymującego się przepływu krwi należy ponownie otworzyć otwór. W przypadku zatrzymania przepływu krwi obserwować naczynie przez 30 s.
nuta: Naczynie klasyfikuje się jako niedrożne, jeśli przepływ stoi w miejscu przez 30 s lub dłużej lub jeśli krew płynie wstecz. Jeśli przepływ krwi w ortogonii zacznie się ponownie, całkowicie otwórz otwór i kontynuuj indukcję skrzepliny, aż dojdzie do niedrożności naczynia, jak opisano powyżej. Podczas wczesnej indukcji skrzepliny należy upewnić się, że czas, w którym otwór był zamknięty w celu sprawdzenia przepływu krwi, był jak najkrótszy, aby utrzymać prawie ciągłe epi-oświetlenie. Później, podczas wzrostu skrzepliny, naczynie jest perfundowane mniej fluorescencyjnym barwnikiem, dzięki czemu można to obserwować w sposób ciągły.
- Wybierz i zamknij 5 naczyń na ucho. Ograniczyć czas indukcji skrzepliny pod mikroskopem do około 1 godziny po wstrzyknięciu FITC-dextranu.
