Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Izolacja pierwotnych monocytów człowieka metodą negatywnej selekcji immunologicznej
- Zbierz 40 ml świeżej, ludzkiej krwi pełnej (od pacjenta z HIV+ lub zdrowej grupy kontrolnej) w czterech probówkach próżniowych z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) o pojemności 10 ml (10 ml krwi na probówkę). Stosując sterylne techniki pod kabiną bezpieczeństwa biologicznego, przenieś wszystkie 40 ml krwi do jednej stożkowej probówki propylenowej o pojemności 50 ml.
- Postępując zgodnie z protokołem producenta dla wybranego zestawu do izolacji monocytów ludzkich (tabela materiałów), dodaj 2 ml koktajlu do izolacji monocytów, dostarczonego w zestawie, do probówki z krwią. Kulki magnetyczne Vortex, również znajdujące się w zestawie, przez 30 s i dodaj 2 ml do probówki z krwią.
- Jeśli dostępnych jest mniej niż 40 ml krwi, zmniejsz ilość dodanych odczynników. Aby wymieszać roztwór, pipetować w górę i w dół plastikową pipetą serologiczną o pojemności 25 ml i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Podzielić mieszaninę krwi równomiernie na cztery probówki o pojemności 50 ml i dodać 30 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającego 1 mM EDTA do każdej probówki. Mieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą plastikowej pipety serologicznej o pojemności 25 ml.
- Umieść probówki w uchwytach magnetycznych na 10 minut, aby usunąć kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami. Użyj jednocześnie czterech uchwytów magnetycznych, po jednym dla każdej probówki, aby zapewnić stały czas inkubacji i izolacji dla każdej próbki krwi.
- Pobrać zawartość ze środka każdej probówki za pomocą pipety, gdy nadal znajduje się w uchwytach magnetycznych. Należy uważać, aby nie pobrać czerwonych krwinek (nie więcej niż 10% początkowej objętości 10 ml) i umieścić ich zawartość w jednej z czterech nowych probówek o pojemności 50 ml.
- Dodać 500 μl wirowanych kulek magnetycznych do każdej probówki o pojemności 50 ml. Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 25 ml i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie umieść rurki w uchwytach magnetycznych na 5 minut.
- Ostrożnie przenieś zawartość ze środka każdej probówki, nadal w uchwytach magnetycznych, do jednej z czterech nowych probówek o pojemności 50 ml. Umieść każdą nową probówkę o pojemności 50 ml bezpośrednio w uchwytach magnetycznych na 5 minut.
- Ostrożnie przenieś zawartość ze środka każdej probówki do jednej z czterech nowych probówek o pojemności 50 ml. Wiruj wszystkie nowe probówki o pojemności 50 ml przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić wszystkie cztery granulki komórkowe w łącznej objętości 10 ml sterylnego PBS.
- Policz komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.
UWAGA: 8-20 x 106 komórek uzyskuje się zwykle z 40 ml krwi pełnej.
2. Hodowla pierwotnych monocytów ludzkich
- Używając łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ciepłe pożywki RPMI 1640 bez surowicy uzupełnione 1% penicyliną-streptomycyną (wstrzykiwacz/paciorkowiec) i (kontynuując stosowanie sterylnych technik w komorze bezpieczeństwa biologicznego) ponownie zawiesić izolowane monocyty w tej pożywce w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.
- Dodać 1 ml zawieszonych komórek do każdego dołka na płytce 6-dołkowej lub do naczynia o średnicy 35 mm (ostateczna liczba komórek powinna wynosić 1 x 106 komórek/płytkę) i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Poczekaj 0,5-1,0 godziny, aż komórki przylgną.
- Używając łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ogrzej inaktywowaną termicznie (HI) płodową surowicę bydlęcą (FBS). Dodać 100 μl (10% stężenia końcowego) FBS do każdej płytki. Dodaj czynniki wzrostu do komórek, aby promować różnicowanie makrofagów.
- Przygotuj makrofagi do fenotypu podobnego do M1, dodając 25 ng / ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) do pożywki. Przygotować makrofagi do fenotypu podobnego do M2, dodając 50 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) do pożywki.
nuta: Zarówno GM-CSF, jak i M-CSF umożliwiają różnicowanie monocytów do ogólnego fenotypu makrofagów (M0), jednocześnie przygotowując komórki odpowiednio do M1 lub M2.
