Układy i składniki odpornościowe

W tym filmie pokazujemy izolację monocytów z pełnej krwi ludzkiej za pomocą immunomagnetycznej separacji ujemnej. Wyizolowane monocyty można wykorzystać do dalszej analizy.

W tym filmie pokazujemy izolację komórek Kupffera lub makrofagów wątrobowych od wątroby myszy. Wątroba jest perfundowana roztworem trawiącym, a następnie rozdzielana w gradiencie gęstości. Wyizolowane przylegające komórki Kupffera można wykorzystać do dalszej analizy.

Ten film demonstruje bezenzymatyczny protokół izolacji makrofagów z ganglionu korzenia grzbietowego myszy (DRG) za pomocą techniki mechanicznej dysocjacji. Po homogenizacji świeżo pobranej tkanki DRG, przeciwciała przeciwko receptorom na powierzchni komórki na makrofagach są używane do fluorescencyjnego znakowania komórek, a następnie wykonuje się cytometrię przepływową w celu potwierdzenia obecności makrofagów w próbce.

W tym filmie pokazujemy izolację limfocytów z pobranej myszy łaty Peyera. Wyizolowane limfocyty można wykorzystać do dalszej analizy.

W tym filmie pokazujemy izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, PBMC, zawierających monocyty i limfocyty z ludzkiej kożuchy przez wirowanie w gradicynacji gęstości. Wyizolowane PBMC można wykorzystać do dalszej analizy.

W tym filmie pokazujemy izolację limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej za pomocą biotynylowanych przeciwciał specyficznych dla komórek innych niż B oraz mikrokulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną.

W tym filmie pokazujemy izolację i hodowlę komórek zrębu szpiku kostnego z długich kości myszy. Izolowane przylegające BMSC mogą być wykorzystane do dalszej analizy.

Ten film pokazuje izolację limfocytów T z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) przy użyciu technologii funkcjonalizowanego sortowania komórek aktywowanych wypornością (BACS). Technika izolacji polega na pozytywnej selekcji limfocytów T CD3 + poprzez znakowanie komórek biotynylowanymi przeciwciałami anty-CD3 i oddzielenie komórek związanych z przeciwciałami za pomocą mikropęcherzyków związanych streptawidyną.

W tym filmie opisujemy protokół aktywacji ludzkich pierwotnych limfocytów T. Inkubacja naiwnych limfocytów T z kulkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, a następnie leczenie interleukiną-2 lub interleukiną-15, prowadzi do aktywacji naiwnych limfocytów T oraz ich różnicowania i proliferacji do efektorowych lub pamięciowych limfocytów T.

W tym filmie pokazujemy izolację leukocytów wątrobowych z wątroby myszy za pomocą wymuszonej perfuzji.

Ten film pokazuje izolację limfocytów, w tym komórek NK lub komórek NK, z ludzkiej tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji. Trawienie enzymatyczne i mechaniczne, po którym następuje separacja w gradieniu gęstości, sprzyja izolacji limfocytów, w tym komórek NK. Pobrane limfocyty mogą być dalej wykorzystywane do selektywnej ekspansji komórek NK.

Ten film demonstruje technikę ekspansji komórek NK (natural killer) bezpośrednio z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą linii komórkowej zasilającej. PBMC są hodowane wspólnie z genetycznie zmodyfikowanymi komórkami odżywiającymi limfoblastoidy eksprymujące interleukinę-21 związaną z błoną (mIL-21), a hodowla jest uzupełniana cytokinami interleukiną-2 (IL-2) i interleukiną-15 (IL-15). Razem ten koktajl ligandów prowadzi do przedłużonej ekspansji komórek NK o wysokiej...

Ten film demonstruje procedurę izolacji komórek Sertoliego z kanalików nasiennych myszy, składnika jąder. Trawienie enzymatyczne i wielokrotne płukanie sprzyjają uwalnianiu komórek Sertoliego do roztworu, który może być dalej hodowany w celu proliferacji i wzrostu.

Ten film demonstruje protokół izolacji opartej na znakowaniu magnetycznym populacji limfocytów T CD4+Vδ1+γδ o niskim stężeniu z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Wykorzystując kombinację przeciwciał anty-Vδ1 sprzężonych z FITC, magnetycznych mikrokulek anty-FITC i superparamagnetycznych kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD4, limfocyty T CD4 + Vδ1 + można z powodzeniem oczyścić z populacji PBMC.

W tym filmie pokazujemy izolację cytotoksycznych neutrofili o wysokiej gęstości i neutrofili o niskiej gęstości z krwi myszy z nowotworem przez nieciągłe wirowanie w gradinie sacharozy.

Ten film pokazuje procedurę izolacji sieci komórek odpornościowych dziąseł od modelu mysiego. Trawienie enzymatyczne uwalnia tkankę dziąsła z przyczepionych zębów i kości, która jest dalej trawiona mechanicznie, uwalniając komórki odpornościowe z dziąsła. Wyizolowane komórki są gotowe do eksperymentów immunologicznych.

Ten film demonstruje metodę płukania otrzewnowej do izolowania dojrzałych komórek tucznych typu tkanki łącznej z jamy otrzewnowej dorosłych myszy. Po wyizolowaniu mieszaniny pierwotnych komórek odpornościowych z jamy otrzewnej przeprowadza się selektywną proliferację komórek tucznych w odpowiednich warunkach hodowli.

W tym filmie opisujemy protokół izolacji komórek CD11b, w tym mikrogleju, z mózgów młodych myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. Tkanki mózgowe są homogenizowane w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, które są inkubowane z mikrokulkami pokrytymi przeciwciałem anty-CD11b, a następnie rozdzielane na podstawie kolumny magnetycznej w celu oczyszczenia populacji komórek CD11b +.

Ten film demonstruje procedurę chirurgicznej izolacji węzła chłonnego drenującego pachwinę na modelu mysim. Nacięcie okolicy brzusznej zapewnia dostęp do pachwinowego węzła chłonnego, który jest pobierany chirurgicznie. Pobrany półprzezroczysty pachwinowy węzeł chłonny można wykorzystać do badań immunologicznych.

Ten film demonstruje technikę preparacji w celu pobrania węzłów chłonnych drenujących podkolanowe z tylnych nóg myszy. Węzły chłonne odgrywają kluczową rolę w łączeniu odporności wrodzonej i nabytej, a pobieranie nienaruszonych węzłów chłonnych – z zachowaną strukturą tkankową i żywotnością komórek – może pomóc w badaniu miejscowych i ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologicznych.

Ten film pokazuje proces wstępowania pierwotnych monocytów do makrofagów. Pierwotne ludzkie monocyty można wyizolować i zróżnicować do fenotypu prozapalnego podobnego do M1 przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub do fenotypu przeciwzapalnego podobnego do M2 za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).

Ten film opisuje metodę in vitro do generowania makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Wytwarzanie makrofagów z iPSC zachodzi w trzech etapach: (i) agregacja iPSC w zawiesinie w celu utworzenia trójwymiarowych ciał zarodkowych (EB), które różnicują się w komórki mezodermalne, (ii) tworzenie komórek prekursorowych makrofagów ze zróżnicowanych EB oraz (iii) różnicowanie komórek prekursorowych makrofagów w dojrzałe, funkcjonalne makrofagi.

W tym filmie demonstrujemy procedurę indukowania różnicowania i polaryzacji monocytów pochodzących z krwi obwodowej na makrofagi M1 lub M2. Inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów, lipopolisacharydem i interferonem-gamma daje prozapalne makrofagi M1, podczas gdy inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów i interleukiną-4 indukuje przeciwzapalną produkcję makrofagów M2.

Ten film demonstruje test in vitro do generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) z popularnych limfoidalnych komórek progenitorowych (CLP). Po jednoczesnej hodowli oczyszczonych CLP z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi w obecności liganda kinazy tyrozynowej-3 (FL) podobnego do Fms, CLP różnicują się w nieprzylegające pDC, których obecność potwierdza się za pomocą cytometrii przepływowej.

Ten film pokazuje wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych (DC) z ludzkich monocytów. Inkubacja monocytów z czynnikami wzrostu i cytokinami prowadzi do produkcji niedojrzałych DC. W odpowiedzi na cząsteczki regulatora immunologicznego niedojrzałe DC różnicują się w tolerogenne i dojrzałe DC.

Ten film pokazuje różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) w adipocyty. W dwuetapowym procesie, w obecności określonych czynników wzrostu i hormonów, niezróżnicowane BMSC najpierw różnicują się w preadipocyty. Drugi etap polegający na leczeniu glukozą i insuliną prowadzi do powstania dojrzałych adipocytów z wieloma kropelkami lipidów.

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Ten film demonstruje protokół generowania funkcjonalnych limfocytów T specyficznych dla antygenu z niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC za pomocą trójwymiarowego systemu hodowli grasicy. Jednoczesna hodowla niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC z endogennymi płatami grasicy płodowymi myszy zubożonymi w limfocyty spowodowała pomyślne dojrzewanie limfocytów T do utworzenia emigrantów grasicy pochodzących z iPSC CD8αβ + + MHC klasy I + (iTE).

W tym filmie opisujemy protokół oczyszczania płytek krwi z pełnej krwi mysiej i ich późniejszej aktywacji za pomocą trombiny agonisty płytek krwi. Podczas analizy za pomocą cytometrii przepływowej, oczyszczone spoczynkowe płytki krwi są charakteryzowane na podstawie ekspresji ich markera powierzchniowego komórki CD41, podczas gdy oczyszczone aktywowane płytki krwi wykazują współekspresję zarówno markerów powierzchniowych CD41, jak i CD62P.

Ten film demonstruje technikę in vitro do generowania i izolowania neutrofili w pułapkach zewnątrzkomórkowych (NET). Neutrofile są izolowane z krwi obwodowej i stymulowane octanem mirystynianu forbolu (PMA) w celu wytworzenia NET. Podczas inkubacji neutrofile przechodzą proces śmierci komórki (NETosis) w celu uwolnienia NET zawierających zdekondensowaną chromatynę zmieszaną z ziarnistymi białkami cytoplazmatycznymi.

Ten film pokazuje in vitro różnicowanie czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów, makrofagów lub komórek pomocniczych T G (THGM). Wyizolowane naiwne limfocyty T są stymulowane do różnicowania się w THGM, co potwierdza się poprzez wykrycie wysokiej wewnątrzkomórkowej produkcji GM-CSF i niskiej ekspresji innych cytokin specyficznych dla komórek T pomocniczych.

Ten film demonstruje test kolorymetryczny do określenia aktywności degranulacyjnej komórek tucznych. Enzym uwalniany przez komórki tuczne hydrolizuje substrat i wytwarza kolorowy produkt. Aktywność degranulacyjną komórek tucznych mierzono jako procentowe uwalnianie enzymów na zewnątrz komórki znormalizowane całkowitą zawartością enzymów w komórce.

W tym filmie opisujemy protokół opartego na cytometrii przepływowej sortowania naiwnych komórek B, komórek B pamięci i subpopulacji komórek plazmatycznych plazmablastów z ludzkich komórek B krwi obwodowej. Różne subpopulacje komórek B można rozróżnić na podstawie wiązania przeciwciał na bazie fluoroforu z receptorami CD19, CD27 i CD38 ulegającymi ekspresji na powierzchni komórek B, a następnie sortowania komórek.

Ten film demonstruje użycie testu ELISpot do oceny funkcji komórek B wydzielających przeciwciała, ASC. Przeciwciała wydzielane przez ASC oddziałują z fragmentami przeciwciał poliklonalnych związanymi z błoną, które są wykrywane przez przeciwciała IgG lub IgM sprzężone z enzymem. Kolorowa plamka wytworzona w każdym dołku wskazuje na obecność specyficznego izotypu przeciwciała, który koreluje z aktywnością wydzielniczą limfocytów B.

W tym filmie opisujemy protokół izolacji pojedynczych komórek z mysich węzłów chłonnych drenujących trzustkę (PDLNs) oraz charakterystykę regulatorowych limfocytów T (Treg) z populacji pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Tregi są identyfikowane na podstawie pozytywnej ekspresji markerów powierzchniowych komórek CD4, CD25 i Nrp1 wraz z jądrowymi czynnikami transkrypcyjnymi Foxp3 i Helios.

Źródło: Bello-Gamboa, A. et al., Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej.J. Vis. Exp.(2019 rok)
Ten film demonstruje badanie in vitro tworzenia synaps immunologicznych między komórką prezentującą antygen a limfocytami T pomocniczymi za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Receptory limfocytów T pomocniczych oddziałują z kompleksem antygenu-MHC-II w komórkach prezentujących antygen i tworzą synapsy immunologiczne, po których następują ruchy pęcherzyków wydzielniczych w kierunku synapsy, co...

W tym filmie demonstrujemy technikę opartą na cytometrii przepływowej, aby określić proporcję indukowanych przez cytokiny limfocytów T, komórek CIK, rozwiniętych z hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.

Ten film demonstruje metodę obrazowania do wizualizacji in situ wydzielania interferonu gamma (IFN-γ) w śledzionie myszy. Po zakażeniu bakteryjnym i indukcji akumulacji IFN-γ w limfocytach T i komórkach NK pobiera się śledzionę od myszy. Po uzyskaniu skrawków tkanek wykonuje się barwienie immunologiczne w celu uwidocznienia IFN-γ wewnątrz komórek.

W tym filmie opisujemy protokół do immunologicznego barwienia i wizualizacji opartej na mikroskopii konfokalnej pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w tkance płucnej myszy. Makrofagi rezydujące w tkankach charakteryzują się ekspresją specyficznego dla makrofagów markera glikoproteiny powierzchniowej F4 / 80, podczas gdy MET są wizualizowane przez znakowanie markerów MET metaloproteinazy macierzy 9, cytrulinowanego histonu H3 i chromatyny zewnątrzkomórkowej.

Ten film demonstruje skuteczną technikę homogenizacji w celu wygenerowania emulsji antygenowo-adiuwantowej do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) w modelu mysim. Emulsja zawiera autoantygen — glikoproteinę mielinową oligodendrocytów (MOG) — w fazie wodnej, otoczoną ciągłą fazą olejową zawierającą inaktywowane bakterie chorobotwórcze. Emulsja zapewnia przedłużone uwalnianie antygenów w celu przedłużenia odpowiedzi immunologicznej.

Ten film demonstruje wizualizację śródnabłonkowych limfocytów γδ (IELs) u myszy transgenicznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zabieg chirurgiczny polega na wytworzeniu linii perforacji i wykonaniu podłużnego nacięcia w celu odsłonięcia błony śluzowej i kosmków jelitowych. Transgeniczne myszy wyrażają białka reporterowe wyłącznie w γδ IELs, umożliwiając ich śledzenie. Obrazowanie przyżyciowe rejestruje dynamiczny ruch IEL γδ znakowanych zieloną fluorescencją wzdłuż błony podstawnej komórki...

Ten film pokazuje wytwarzanie i izolację mikrocząsteczek pochodzących z limfocytów T, LMP, z limfocytów T po leczeniu aktynomycyną-D.

Ten film opisuje protokół izolacji limfocytów T CD8+ specyficznych dla rzadkiego antygenu za pomocą magnetycznych komórek prezentujących sztuczny antygen oparty na nanocząstkach (aAPC) funkcjonalizowanych antygenowymi peptydami MHC-Igs i przeciwciałami anty-CD28. Interakcja aAPC z limfocytami T CD8 + specyficznie eksprymującymi receptory limfocytów T ukierunkowanych na peptydy antygenowe, a następnie ich ekspansję in vitro, powoduje wzbogacenie i ekspansję tej populacji limfocytów T CD8 +.

Ten film pokazuje oddzielanie neutrofili od wydzielin tchawicy za pomocą urządzenia mikroprzepływowego ze spiralnymi kanałami. Urządzenie osiąga wydajną separację w zależności od wielkości komórki dzięki wykorzystaniu różnych grubości i kanałów w kształcie trapezu. Wzajemne oddziaływanie sił powoduje, że duże neutrofile gromadzą się w pobliżu ściany wewnętrznej, podczas gdy erytrocyty i agregaty mucyny pozostają w pobliżu ściany zewnętrznej, zapewniając skuteczną separację neutrofili.

W tym filmie demonstrujemy wewnątrzkomórkowe znakowanie radiokomórkowe komórek pomocniczych T za pomocą radioaktywnych przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z izotopami do nieinwazyjnego obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej.