Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja i hodowla PMC za pomocą płukania dootrzewnowego
- Izolacja PMC przez płukanie dootrzewnowe
- Przed izolacją komórek należy przygotować materiały wymienione w tabeli 1.
- Użyj samców myszy w wieku od 8 do 14 tygodni do izolacji PMC. Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 i potwierdź śmierć przez utratę odruchów. Spryskaj mysz 70% etanolem i przymocuj ją do bloku piankowego za pomocą szpilek (grzbietem do dołu). Usuń brzuszną skórę myszy za pomocą nożyczek o krawędziach. Unikać uszkodzenia jamy otrzewnej.
nuta: Zazwyczaj używamy tego protokołu dla myszy z tłem genetycznym szczepu C57BL/6N.
- Wstrzyknąć 7 ml lodowatego podłoża RPMI i 5 ml powietrza do jamy otrzewnej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę 27 G. Ostrożnie wbić igłę w otrzewną i nie przebijać żadnych narządów. Użyj miejsca w okolicy tłuszczu najądrza, aby zmniejszyć ryzyko perforacji narządu.
- Po wstrzyknięciu należy potrząsać myszą przez 1 minutę, aby odłączyć komórki otrzewnej od podłoża RPMI. Nie potrząsaj myszą zbyt mocno, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych i zanieczyszczenia jamy otrzewnej krwią.
- Ponownie użyj strzykawki o pojemności 10 ml, wyposażając ją w nową kaniulę 20 G. Przesuń narządy wewnętrzne na jedną stronę, przechylając blok piankowy i delikatnie stukając nim o ławkę, aby ułatwić aspirację podłoża z drugiej strony. Włóż igłę 20 G, delikatnie i powoli odessaj płyn z jamy brzusznej (~0,5 ml/s), aby uniknąć zatkania przez narządy wewnętrzne. Zbierz jak najwięcej płynu (zwykle 5–6 ml).
- Wyjąć igłę ze strzykawki i przenieść zawiesinę pobranych komórek do probówki pobranej na lodzie. Wyrzuć probówkę z próbką, jeśli widoczne jest zanieczyszczenie krwi.
- Odwirować probówki z zawiesiną komórek o sile ~300 x g przez 5 min. Pod sterylnym kapturem odessać supernatant. Dla każdej myszy połączyć osady próbki w 4 ml zimnej (4–10 °C) pożywki PMC i przenieść zawiesinę komórek do kolby hodowlanej o średnicy 25 cm2. Dodać czynniki wzrostu IL-3 i SCF do końcowych stężeń odpowiednio 10 ng/ml i 30 ng/ml. Umieścić kolbę zawierającą komórki w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) i inkubować przez ~48 godzin do następnego zabiegu.
- Kultura PMC
- Dzień 2 (~48 h po izolacji): Zmiana podłoża
- Aby usunąć komórki sklarowane nad osadem i nieprzylegające (erytrocyty i martwe komórki), należy odessać pożywkę z kolby, umieszczając końcówkę pipety Pasteura na krawędzi kolby i trzymając kolbę prawie poziomo. Dodaj 4 ml wstępnie podgrzanego podłoża PMC Medium na mysz. Dodać czynniki wzrostu IL-3 (10 ng/ml) i SCF (30 ng/ml). Umieścić kolbę zawierającą komórki w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ).
- Dzień 9: Podział komórek
- Przenieść zawiesinę komórkową z kolby do hodowli komórkowej do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przemyć kolbę trzykrotnie 10 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco, zbierając zawiesinę komórkową wraz z odłączonymi komórkami do tej samej probówki wirówkowej z tworzywa sztucznego o pojemności 50 ml. Policz stężenie komórek za pomocą hemocytometru i oblicz całkowitą liczbę komórek.
- Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu ~300 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Odzyskać osad we wstępnie podgrzanym podłożu PMC (37 °C), aby uzyskać stężenie komórek 1 x 106 komórek/ml. Przenieść zawiesinę komórek do nowej kolby hodowlanej o średnicy 25cm2. Wyrzuć starą kolbę z fibroblastami przylegającymi do dna.
- Dodać czynniki wzrostu IL-3 (10 ng/ml) i SCF (30 ng/ml) i umieścić kolbę zawierającą komórki w inkubatorze (37 °C i 5%CO2).
- Dni 12–15: Pomiary komórek
- Jeśli planowane są jakiekolwiek eksperymenty ze stymulacją receptorów FcɛRI, należy wstępnie potraktować komórki przez noc 300 ng/ml IgE anty-DNP w standardowej pożywce hodowlanej.
2. Pomiar uwalniania beta-heksosaminidazy w PMC
- Przed pomiarami należy przygotować materiały wymienione w tabeli 2.
UWAGA: β-heksozaminidaza uwalniana z MC po ich stymulacji hydrolizuje p-nitrofenylo-acetylo-D-glukozaminę (pNAG) do p-nitrofenolu i N-acetylo-D-glukozaminy. Ilość β-heksozaminidazy w próbce jest proporcjonalna do ilości p-nitrofenolu, który zostanie utworzony. W środowisku o wysokim pH "Stop Solution" p-nitrofenol występuje jako całkowicie zdeprotonowany p-nitrofenolat i można go wykryć na podstawie absorbancji światła przy 405 nm.
- Przygotuj roztwór Tyrode'a zawierający 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5,6 mM glukozy i BSA 0,1%. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 3 M NaOH.
- Przygotuj roztwór do lizy, dodając 1% objętości Triton X-100 do roztworu Tyrode.
- Przygotować roztwór zatrzymujący składający się z 200 mM glicyny i dostosować pH do 10,7 za pomocą NaOH.
- Przygotować roztwór pNAG (4-nitrofenylo 2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozyd), rozpuszczając pNAG w 0,4 M kwasie cytrynowym do końcowego stężenia 4 mM.
- Oblicz ilość komórek potrzebnych do testu (wykonaj test w dwóch egzemplarzach). Użyj 200 000 PMC na dołek. Użyj 2 studzienek jako kontroli ujemnych (roztwór Tyrode'a bez żadnych substancji wydzielających, takich jak DNP lub związek 48/80) i 2 studzienek jako kontroli dodatnich (roztwór Tyrode'a z 10 μM jonomycyną) dla każdego genotypu.
- Przenieść komórki do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, dostosować objętość do 15 ml roztworem Tyrode'a i odwirować przy 200 x g przez 4 minuty. Usunąć supernatant za pomocą pipety Pasteura i ponownie zawiesić komórki w roztworze Tyrode'a do 2 x 10 6 komórek/ml.
- Przenieść 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Dodać 25 μl roztworu stymulującego lub kontrolnego do każdej studzienki (zgodnie ze schematem pipetowania przedstawionym na rysunku 1A). Inkubować komórki przez 45 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Zatrzymaj reakcję, umieszczając 96-dołkową płytkę na lodzie na 5 minut. Następnie odwirować płytkę w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 120 x g. Przenieść 120 μl supernatantu za pomocą pipety wielokanałowej na płaskodenną 96-dołkową płytkę i umieścić ją na lodzie. Ostrożnie unikaj dotykania osadów komórkowych, ale całkowicie zasysaj supernatant.
- Dodać 125 μl buforu do lizy do granulek komórek. Inkubować granulki komórkowe przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić je po inkubacji przez wielokrotne pipetowanie (około 5 razy).
- Odpipetować 25 μl roztworu pNAG (4 mM) do wymaganych studzienek nowej płaskodennej 96-dołkowej płytki. Dodać 25 μl z każdego supernatantu do przygotowanego roztworu pNAG, a także 25 μl każdego lizatu komórkowego.
- Inkubować partie reakcyjne przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Po inkubacji odpipetować 150 μl roztworu zatrzymującego do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję.
- Przeanalizuj płytkę za pomocą czytnika mikropłytek, używając ustawienia podwójnej długości fali na 405 nm z odniesieniem 630 nm w celu automatycznego odejmowania tła. W programie akwizycji należy zaznaczyć pole "Odniesienie" i w menu elementu programu "Absorbancja" wybrać z listy rozwijanej "630 nm". Jeżeli gęstość optyczna próbek jest zbyt wysoka, należy przygotować odpowiednie rozcieńczenie sondy przed ponownym pomiarem.
Tabela 1: Materiały do Kroku 1.
| 1 | lód |
| cyfra arabska | Strzykawki 10 ml |
| 3 | Igły 27 G |
| 4 | Igły 20 G |
| 5 | Blok styropianowy i kołki |
| 6 | Probówki zbiorcze (plastikowe probówki wirówkowe 50 ml) |
| 7 | 70% etanolu |
| 8 | RPMI Medium (wstępnie schłodzone i przechowywane na lodzie) |
| 9 | PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (płodowa surowica cielęca) + 1% roztwór penicyliny Streptomycyny (Pen-Strep) |
| 10 | Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco - DPBS (bez Ca2+ i Mg2+) |
| 11 | Kolby hodowlane (25 cm) |
| 12 | Roztwory podstawowe czynników wzrostu (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/ml) |
| 13 | Pipety serologiczne (10 ml) |
| 14 | Końcówki do pipet sterylne (20–200 μl) |
| 15 | Hemocytometr |
| 16 | Wirówka stołowa |
| 17 | Nożyczki i kleszcze |
| Rozdział 18 | Komora CO2 dla myszy |
| Rozdział 19 | Otwarty sterylny kaptur |
| 20 | Zamknięty sterylny kaptur |
| 21 | Inkubator komórkowy (37 °C i 5% CO2 ) |
| 22 Rozdział 22 | Pipety transferowe (20–200 μl) |
Tabela 2: Materiały do Kroku 2.
| 1 | PMC (12–15 dni) 1 x 106 komórek/ml |
| cyfra arabska | Roztwór podstawowy przeciwciała anty-DNP (IgE) |
| 3 | Roztwór podstawowy DNP-HSA |
| 4 | Związek 48/80 roztwór podstawowy |
| 5 | Jonomycyna |
| 6 | Płytka 96-dołkowa, dno w kształcie litery V |
| 7 | Płytki 96-dołkowe, płaskie dno |
| 8 | Probówki wirówkowe z tworzywa sztucznego (15 ml) |
| 9 | Pipety serologiczne |
| 10 | Inkubator komórkowy (37 °C i 5% CO2 ) |
| 11 | Wirówka stołowa |
| 12 | Czytnik płytek mikromiareczkowych do pomiarów gęstości optycznej |
| 13 | Pipeta wielokanałowa (20–200 μl) |
| 14 | Hemocytometr |
