Izolacja i hodowla mysich komórek Kupffera

Streszczenie

Źródło: Bourgognon, M., et al. Izolacja komórek Kupffera do testów toksyczności nanocząstek. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie pokazujemy izolację komórek Kupffera lub makrofagów wątrobowych od wątroby myszy. Wątroba jest perfundowana roztworem trawiącym, a następnie rozdzielana w gradiencie gęstości. Wyizolowane przylegające komórki Kupffera można wykorzystać do dalszej analizy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Perfuzja i zbieranie komórek (Rysunek 1)

1. Przygotować na świeżo wszystkie odczynniki opisane w tabeli materiałów.
2. Podgrzewać roztwór EGTA (kwas tetraoctowy glikolu etylenowego)/HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanka) (50 ml na mysz) i roztwór kolagenazy (100 ml na mysz) przez 30 minut w temperaturze 40 °C.
3. Najpierw przepłucz elastyczny przewód pompy 70% etanolem. Wlać 40 ml roztworu EGTA/HBSS do probówki wirówkowej zanurzonej w łaźni wodnej i przepłukać elastyczny przewód pompy wstępnie podgrzanym roztworem EGTA/HBSS.
4. Wykonaj znieczulenie końcowe za pomocą barbituranu, aby niezawodnie spowodować utratę przytomności przed depresją oddechową i śmiercią. Wstrzyknąć fenobarbiton w dawce 1 mg/kg, i.p. samicy lub samca myszy CD1 (35-45 g). Potwierdź znieczulenie, szczypiąc palec u nogi.
5. Ogolić włosy na brzuchu i wysterylizować powierzchnię brzucha za pomocą 70% roztworu etanolu.
6. Przeciąć jamę brzuszną i odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną dolną, przesuwając jelito na boki po lewej stronie brzucha.
7. Uruchomić pompę z prędkością 1-3 ml/min z roztworem EGTA/HBSS i kaniulować żyłę wrotną za pomocą igły motylkowej o wadze 23 g (nacięcie skrzydeł). Zacisnąć odcinek żyły wzbiorczej kaniulowany igłą 23 G, a następnie odwrócić ząbkowane kleszcze na powierzchni otwartego brzucha myszy. Wątroba powinna szybko zblednąć w ciągu pierwszych 30 sekund od perfuzji roztworu EGTA/HBSS.
8. Szybko naciąć dolną część żyły głównej dolnej, aby uniknąć nadmiernego wzrostu ciśnienia w wątrobie, a następnie stopniowo zwiększać szybkość przepływu do 7 ml/min w ciągu pierwszej minuty perfuzji. Zwierzę umiera z powodu krwawienia wtórnego do nakłucia żyły głównej.
9. Gdy w probówce wirówkowej pozostało mniej niż 5 ml roztworu EGTA/HBSS, napełnij ją roztworem kolagenazy (40-50 ml). Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu do 10 ml/min, przez 30 sekund.
10. Spraw, aby wątroba puchła, wywierając nacisk na żyłę główną dolną za pomocą pęsety w odstępach 5-10 sekund. Można to robić okresowo (5-10 razy podczas trawienia). Ten krok poprawi dysocjację komórek wątroby i skróci czas perfuzji z kolagenazą.
11. Gdy w probówce wirówkowej pozostanie mniej niż 10 ml roztworu kolagenazy, wlej 40-50 ml wstępnie podgrzanego roztworu kolagenazy do probówki wirówkowej.
12. Po 10-15 minutach perfuzji i około 70-80 ml perfuzji roztworu kolagenazy należy lekko uciskać powierzchnię wątroby kleszczami. Odcisk ciśnienia wskazuje, że komórki wątroby są zdysocjowane.
13. Wyjmij wątrobę z jamy brzusznej w jednym kawałku i umieść ją w probówce wirówkowej zawierającej 20-30 ml pożywki do izolacji komórek Kupffera. Komórki wątroby należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez okres maksymalnie 3 godzin, aby uniknąć wpływu na żywotność komórek wątroby.
14. W razie potrzeby powtórzyć procedurę perfuzji na kilku zwierzętach, utrzymując perfundowaną wątrobę na lodzie. Zbierz od jednej do trzech wątrób w celu oczyszczenia i przejdź do etapu 3.

2. Przygotowanie gradientu gęstości do wirowania (Rysunek 2)

1. Postępować zgodnie z poniższymi krokami (sekcje 2, 3 i 5) w sterylnych warunkach i utrzymywać komórki na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Przygotować SIP (roztwór cząstek krzemionki pokrytych izotonicznie) mieszając 15,3 ml powlekanego roztworu cząstek krzemionki z 1,7 ml 10 x PBS.
2. Aby przygotować 20 ml 25% roztworu SIP, zmieszaj 5 ml SIP z 15 ml PBS. Aby przygotować 20 ml 50% roztworu SIP, zmieszaj 10 ml SIP z 10 ml PBS.
3. Napełnić jedną probówkę wirówkową 20 ml 50% roztworu SIP. Przechylić probówkę wirówkową pod kątem zbliżonym do 90° i powoli dodać 25% roztwór SIP (20 ml) na boczną ściankę probówki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml, nie dotykając powierzchni warstwy 50% SIP. Dodając 25% roztwór SIP, stopniowo zmniejszaj kąt rurki. Utrzymuj gradient gęstości na lodzie do czasu użycia.

3. Oczyszczanie komórek Kupffera (Rysunek 3)

1. Umieścić jedną perfundowaną wątrobę na szalce Petriego z 15 ml pożywki do izolacji komórek Kupffera. Rozerwij torebkę Glissona (błonę wątroby) za pomocą nożyczek i uwolnij wszystkie komórki wątroby do pożywki do izolacji komórek Kupffera. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 100 μm, aby zebrać go w probówce wirówkowej. Powtórzyć procedurę perfuzji na dodatkowych perfundowanych wątrobach i zebrać komórki w tej samej probówce wirówkowej (15 ml od jednej myszy i do 45 ml od trzech myszy).
2. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 50 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Komórki miąższowe (hepatocyty) znajdują się w osadzie, a komórki niemiąższowe (w tym komórki Kupffera) znajdują się w supernatancie.
3. Zebrać supernatant do czystej probówki wirówkowej i wirować przy 50 x g przez 2 minuty każdy. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy.
4. Wirować przy 1 350 g przez 15 minut w celu osadzenia komórek niemiąższowych. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki do izolacji komórek Kupffera.
5. Dodać niemiąższowy roztwór komórek o nieciągłym gradieniu izotonicznym 25/50%, jak opisano w ppkt 2.3. Wirować przy 850 x g przez 15 minut bez przyspieszania i hamowania.
6. Zlokalizuj wzbogaconą frakcję komórek Kupffera, która wydaje się mętna, w obrębie 25% frakcji SIP w pobliżu interfejsu 25/50% SIP (ryc. 3). Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml odessać około 12 ml wzbogaconej frakcji komórek Kupffera. Przenieść komórki do probówki wirówkowej zawierającej 35-40 ml pożywki do izolacji komórek Kupffera. Delikatnie wymieszać i odwirować przy 1 350 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C do uzyskania komórek osadu.
7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5-10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych Kupffera. Policz komórki (hemocytometr) i zmierz żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
8. Umieść oczyszczone komórki niemiąższowe na 24-dołkowych płytkach o gęstości 5 x 10⁵ komórek/basenik. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ (rysunek 3). Po 30 minutach delikatnie usuń pożywkę, przemyj ją wstępnie podgrzanym roztworem soli Hanka (HBSS), a następnie zastąp ją 500 μl świeżej i wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych Kupffer (na dołek).

Wyniki

Rycina 1: Perfuzja wątroby. Po znieczuleniu myszy przewód pokarmowy przesuwa się bocznie na lewo od brzucha, aby umożliwić dostęp do żyły wrotnej (PV). PV jest kaniulowany przy użyciu roztworu EGTA/HBSS o powolnym natężeniu przepływu (1-3 ml/min), a żyła główna dolna (IVC) jest natychmiast pękana, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia w wątrobie. W ciągu pierwszej minuty perfuzji szybkość przepływu jest...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Euthatal (pentobarbital sodu)	Merial
Myszy CD1	Rzeka Karola	-	Waga myszy powinna wynosić od 35 do 45 g. Zalecamy stosowanie samców myszy CD1, ponieważ ich waga szybko rośnie (np. samiec myszy CD1 w wieku 7 tygodni przekracza wagę 35 g). Zaleca się również wcześniejsze skontaktowanie się z dostawcą zwierząt w celu umówienia się na dostawę starszych zwierząt. Alternatywnie zwierzęta mogą przebywać w domu, aby osiągnąć pożądaną wagę.
HBSS (wolny od Ca2+ i Mg2+, z wodorowęglanem)	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 14175-053	HBSS musi być wolny od Ca2+.
Sól tetrasodowa kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego (EGTA)	Sigma-Aldrich	E8145	EDTA może być również stosowany, ale EGTA ma tę zaletę, że selektywnie chelatuje Ca2+.
HEPESY (1M)	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 15630-056	Pojemność 100 ml
Kolagenaza typu IV	Worthington	Zobacz materiał CSL-4	Zaleca się przetestowanie różnych partii kolagenazy lub przynajmniej wspomnienie dostawcy, że produkt musi być odpowiedni do izolacji komórek wątroby
Niski poziom glukozy DMEM	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D5523	Pojemność 500 ml
RPMI (z pirogronianem sodu i Glutamaxem®)	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 12633-012	Pojemność 500 ml
Penicylina/steptomycyna	Technologie życiowe	Rozdział 15140-122	Pojemność 100 ml
Surowica bydlęca płodu	Pierwsze ogniwo	tel. 60-00-850	Pojemność 500 ml
Roztwór błękitu trypanowego	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8154	Pojemność 100 ml
Powlekany roztwór cząstek krzemionki (Percoll®)	GE Healtcare	Numer katalogowy: 17-0891-02	Percoll® jest bardzo stabilny i może być przechowywany przez kilka lat
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Technologie życiowe	Numer katalogowy 10010-023	Pojemność 500 ml
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Technologie życiowe	Nr kat. 70011-036	Pojemność 500 ml
Zestaw do pobierania krwi motyla (rurka o długości 23G/305mm)	Bd	367288
Filtry strzykawkowe (0,22 μm z niebieską obwódką)	Minisart (Minisart)	16534-K
Probówki wirówkowe (50 ml niebieska nakrętka)	BD Nauki Biologiczne, Sokół	35 2070
szalka Petriego (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał BSN 101VR20
Sitko do komórek 100 μm	Bd	Numer telefonu 352360
Pompa perystaltyczna	Watsona Marlowa	SciQ 300	Przepłucz rurki przed i po każdym użyciu sterylnym PBS i 70% etanolem.
Płytki 24-dołkowe	Corning	3526
wirówka	Eppendorf	Zobacz materiał 5810R
Kleszcze Serrefine	Hammacher GmbH	Nr art. HSE 004-35 / nr kat. 221-0051	Kleszczyki serrefine pozwalają na zaciśnięcie naczynia kaniulowanego igłą 23G bez konieczności trzymania kleszczyków podczas zabiegu perfuzji. Adres URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Skrobak do komórek	BD Nauki Biologiczne, Sokół	353086	Wytnij kończyny ostrzy nożyczkami, aby zeskrobać komórki w 24-dołkowych płytkach.
Roztwór EGTA (kwas tetraoctowy glikolu etylenowego)/HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanka)			HBSS zawierający 0,5 mM EGTA i 25 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,4. Przygotować 50 ml na każdą wątrobę do perfuzji.
Roztwór kolagenazy			DMEM o niskiej zawartości glukozy zawierającej kolagenazę typu IV w stężeniu 100 UI/ml, 15 mM HEPES i 1% Penicllin/Streptamycyny (v / v). Dostosuj pH do 7,4. Przygotować 100 ml na każdą wątrobę do perfuzji. Po dodaniu kolagenazy zaleca się podgrzanie roztworu przez 30 minut przed użyciem. Dzięki temu aktywność kolagenazy jest optymalna.
Pożywka do izolacji komórek Kupffera			RPMI zawierające: 1% aminokwasów endogennych (v/v), 1% glutamax® (v/v) i 1% peniclin/streptomycyny (v/v). Przygotuj co najmniej 100 ml na 1-3 wątróbki.
Pożywka do hodowli komórkowych Kupffera			RPMI zawiera 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% aminokwasów endogennych (v/v), 1% Glutamax® (v/v) i 1% Penicllin/Streptamycyny (v/v). Przygotuj co najmniej 100 ml na 1-3 wątróbki.
SIP (roztwór cząstek krzemionki pokrytych izotonicznie)			Zmieszaj 1,7 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 15,3 ml Percollu®, aby uzyskać 17 ml SIP.
25% roztwór SIP			Zmieszać 5 ml SIP z 15 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami
50% roztwór SIP			Wymieszaj 10 ml SIP z 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami
Bufor do lizy			Media DMEM z 0,9% Triton X-100
Rozwiązanie PBS/BSA			Przygotuj świeżą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami o pH 7,4 z 1% albuminą surowicy bydlęcej.

powiedział: TGL TGL powiedział: