Zoptymalizowana detekcja Mycoplasma metodą PCR

Podsumowanie

Zestaw do wykrywania Mycoplasma metodą PCR LookOut wykorzystuje reakcję polimerazy łańcuchowej (PCR), która jest uznawana za metodę z wyboru zapewniającą najwyższą czułość w wykrywaniu zanieczyszczeń Mycoplasma, Acholeplasma i Ureaplasma w hodowlach komórkowych oraz innych produktach biologicznych pochodzenia komórkowego.

Streszczenie

Utrzymanie linii komórkowych wolnych od zanieczyszczeń jest niezbędne w badaniach opartych na komórkach. Jednym z największych problemów w zakresie kontaminacji jest zakażenie mycoplasma. Chociaż mycoplasma zazwyczaj nie zabijają zakażonych komórek, są one trudne do wykrycia i mogą wywoływać szereg efektów w komórkach hodowlanych, w tym zmieniony metabolizm, spowolnioną proliferację oraz aberracje chromosomalne. Krótko mówiąc, kontaminacja mycoplasma obniża wartość tych linii komórkowych w dostarczaniu dokładnych danych dla badań nauk o życiu.

Źródła kontaminacji mycoplasmapodobnymi w laboratorium są bardzo trudne do całkowitego opanowania. Ponieważ niektóre gatunki mycoplasma występują na ludzkiej skórze, mogą one zostać wprowadzone do hodowli wskutek niewłaściwej techniki aseptycznej. Dodatkowo mogą one pochodzić z zanieczyszczonych dodatków, takich jak płodowa surowica bydlęca, a przede wszystkim z innych skontaminowanych kultur komórkowych. Gdy mycoplasma zanieczyści kulturę, może się ona szybko rozprzestrzenić, prowadząc do kontaminacji innych obszarów laboratorium. Kluczem do sukcesu jest ścisłe przestrzeganie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej, takich jak właściwa technika aseptyczna, a w celu skutecznego opanowania zanieczyszczeń wysoce zaleca się rutynowe testowanie pod kątem obecności mycoplasma.

Wykrywanie mycoplasma metodą PCR stało się bardzo popularnym sposobem rutynowego monitorowania linii komórkowych. Metody detekcji oparte na PCR są wysoce czułe i pozwalają na szybkie uzyskanie wyników, co w porównaniu do technik mikrobiologicznych umożliwia badaczom szybszą reakcję w celu wyizolowania i usunięcia kontaminacji po jej wykryciu. Zestaw LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit charakteryzuje się wysoką czułością, z granicą detekcji wynoszącą zaledwie 2 genomy na μl. Dzięki zastosowaniu wysoce specyficznej polimerazy JumpStart Taq DNA Polymerase oraz autorskiego projektu starterów znacznie zredukowano liczbę wyników fałszywie dodatnich. Praktyczny format 8 probówek, paski pokryte dNTP oraz dołączone startery pomagają zwiększyć przepustowość, aby sprostać potrzebom użytkowników posiadających duże kolekcje linii komórkowych.

Ze względu na ekstremalną czułość zestawu, należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec przypadkowemu zanieczyszczeniu próbek i odczynników. Prezentowany przez nas protokół krok po kroku podkreśla środki ostrożności i praktyki niezbędne do wiarygodnego wykrywania mycoplasma. Przedstawiamy i omawiamy również typowe wyniki oraz ich interpretację. Naszym celem jest zapewnienie sukcesu badaczom korzystającym z zestawu LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

Protokół

1. Wykrywanie Mycoplasma

1. Nadnadpłyny z hodowli komórkowych można badać bezpośrednio lub przygotować próbki do późniejszego użycia. Aby przygotować je do późniejszego użycia, należy umieścić 100 μl nadnadpłynu w sterylnej probówce do amplifikacji i inkubować w 95° C przez 5 minut. Po zakończeniu tej procedury próbki można przechowywać w temperaturze 2-8° C do jednego tygodnia. Bezpośrednio przed analizą próbki należy krótko odwirować (5 sekund), aby osadzić resztki komórkowe.
2. W celu przygotowania próbek do PCR należy określić całkowitą objętość polimerazy Jumpstart Taq DNA/buforu do rehydratacji wymaganą do reakcji. Przygotujemy łącznie 5 reakcji. Pięć reakcji będzie wymagało 2,5 μl Taq i 114,5 μl buforu do rehydratacji. Zapewni to minimum jedną jednostkę Taq na reakcję oraz 22,5 μl buforu do rehydratacji na każdą reakcję z próbką i kontrolę negatywną, plus 24,5 μl buforu do rehydratacji dla kontroli pozytywnej. Do odpowiedniej objętości buforu do rehydratacji należy dodać 1 jednostkę polimerazy DNA na reakcję. Wartość ta zależy od stosowanej polimerazy Taq.
3. Obliczoną objętość polimerazy Taq DNA należy przenieść do czystej probówki do mikrocentryfugi, a następnie dodać obliczoną objętość buforu do rehydratacji. Polimerazę DNA i bufor do rehydratacji należy wymieszać delikatnie, potrząsając probówką. Mieszaniny nie wolno mieszać w wstrząsaczu vortex.
4. Do przygotowania kontroli negatywnej oraz próbek należy użyć przezroczystych probówek do reakcji dołączonych do zestawu. Probówki te zawierają już nukleotydy, primery oraz DNA kontroli wewnętrznej. Do każdej z probówek z kontrolą negatywną i próbkami należy przenieść 23 μl mieszaniny Jumpstart Taq DNA Polymerase/bufor do rehydratacji, przygotowanej w poprzednich krokach. Do kontroli negatywnej należy dodać 2 μl wody wolnej od DNA, a do każdej z probówek z próbkami dodać 2 μl próbki i opisać je. Zawartość należy wymieszać, potrząsając probówkami. Zawartości nie wolno mieszać w wstrząsaczu vortex.
5. Do przygotowania kontroli pozytywnej należy użyć różowych probówek do reakcji dołączonych do zestawu. Probówki te zawierają już nukleotydy, primery oraz DNA kontroli wewnętrznej. Do probówek do reakcji należy dodać 25 μl mieszaniny Jumpstart Taq DNA polymerase/bufor do rehydratacji, przygotowanej w poprzednich krokach, i opisać je. Zawartość należy wymieszać, potrząsając probówkami. Zawartości nie wolno mieszać w wstrząsaczu vortex. Kontrolę negatywną, kontrolę pozytywną i probówki z próbkami należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
6. Aby przeprowadzić reakcję PCR, próbki należy umieścić w termocyklerze. Przy zastosowaniu JumpStart Taq etap aktywacji nie jest wymagany. Probówki do reakcji należy umieścić w termocyklerze. Cykle należy ustawić w następujący sposób: 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 40 sekund. Cykle te należy powtórzyć 40 razy.
7. Po zakończeniu cykli PCR próbki należy schłodzić do 4-8°C, wyjmując je z termocyklera i umieszczając w lodzie. Po schłodzeniu próbek należy nanieść je na żel agarozowy do elektroforezy. Żel do nakładania oraz barwnik nie są konieczne, ponieważ znajdują się one już w probówkach do reakcji. Należy nanieść bezpośrednio 8 μl z każdego PCR do osobnej ścieżki. Elektroforezę należy przerwać po migracji na odległość 2,5 - 3,0 cm.

2. Reprezentatywne wyniki

Kontrola negatywna powinna wykazywać prążek o wielkości około 481 bp. Jest on widoczny w kolumnie kontroli negatywnej na żelu elektroforetycznym pokazanym na początku filmu. Brak prążka kontroli negatywnej przy 481 bp jest dobrym wskaźnikiem tego, że aktywność polimerazy była niewystarczająca lub użyta Taq nie była wystarczająco czuła.

Próbki dodatnie pod kątem obecności Mycoplasma będą wykazywać prążki w zakresie 270 ± 8 bp. Prążek będzie wyraźny w przypadku próbek silnie zanieczyszczonych i słaby w przypadku próbek lekko zanieczyszczonych. Różnice w intensywności są widoczne w kolumnach próbek dodatnich na żelu elektroforetycznym pokazanym na początku filmu. Wszystkie próbki zawierają wewnętrzną kontrolę negatywną, aby wykazać, że reakcja PCR przebiegła zgodnie z oczekiwaniami. Brak kontroli wewnętrznej w próbkach silnie zanieczyszczonych jest zjawiskiem normalnym.

Jeśli w próbce nie pojawi się prążek w zakresie dodatnim ani w zakresie ujemnym, jest to istotny wskaźnik tego, że próbki są inhibowane. W przypadku wystąpienia inhibicji próbki, inhibitory PCR można usunąć, przeprowadzając ekstrakcję DNA.

Rysunek 1. Odpowiednie prążki amplikonów: Przedstawiono wyniki wykrywania mycoplasma za pomocą PCR. Ścieżka 2 to kontrola negatywna, która powinna wykazać prążek o wielkości około 481 bp. Brak prążka kontroli negatywnej przy 481 bp jest dobrym wskaźnikiem tego, że zastosowana polimeraza Taq nie była wystarczająco czuła. Próbki dodatnie pod kątem obecności mycoplasma wykażą prążki w zakresie 270 + 8 bp, jak pokazano w ścieżkach 3–6. Prążek będzie intensywny dla próbek silnie skontaminowanych (ścieżka 6) i słabo widoczny dla próbek lekko skontaminowanych (ścieżka 4). Wszystkie próbki zawierają wewnętrzną kontrolę negatywną (481 bp), aby wykazać, że reakcja PCR przebiegła zgodnie z oczekiwaniami. Brak kontroli wewnętrznej w próbkach silnie skontaminowanych jest zjawiskiem normalnym.

Dyskusja

Ze względu na ekstremalną czułość zestawu, przy prawidłowym wykonaniu powinien on dostarczyć precyzyjne wyniki wskazujące, czy próbka jest zanieczyszczona mycoplasmas. Zestaw został zoptymalizowany do pracy z JumpStart Taq DNA Polymerase. Podczas przygotowywania próbek można stosować inne polimerazy Taq, jednak pas kontroli wewnętrznej przy 481 bp powinien być widoczny, aby potwierdzić odpowiednią czułość zastosowanej alternatywnej polimerazy Taq. Pasma dodatnie mogą wykazywać różną intensywność w zależności od stopnia zanieczyszczenia. W przypadku próbek silnie zanieczyszczonych może wystąpić brak pasma kontroli wewnętrznej. Zachowanie ostrożności i stosowanie właściwej techniki podczas przygotowywania próbek w celu zapobiegania kontaminacji jest kluczowe dla prawidłowej detekcji przy użyciu zestawu LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do detekcji mycoplasmy metodą PCR LookOut	Sigma-Aldrich	MP0035
Polimeraza DNA Taq JumpStart	Sigma-Aldrich	D9307
Zestaw do izolacji genomowego DNA z krwi GenElute	Sigma-Aldrich	MP0030
Probówki do amplifikacji Nunc	Sigma-Aldrich	T0447