Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w makrofagi

Streszczenie

Źródło: Lopez-Yrigoyen, M., et al. Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film opisuje metodę in vitro do generowania makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Wytwarzanie makrofagów z iPSC zachodzi w trzech etapach: (i) agregacja iPSC w zawiesinie w celu utworzenia trójwymiarowych ciał zarodkowych (EB), które różnicują się w komórki mezodermalne, (ii) tworzenie komórek prekursorowych makrofagów ze zróżnicowanych EB oraz (iii) różnicowanie komórek prekursorowych makrofagów w dojrzałe, funkcjonalne makrofagi.

Protokół

1. Różnicowanie ludzkiego iPSC do makrofagów

UWAGA: Schematyczne podsumowanie protokołu różnicowania makrofagów jest przedstawione na rysunku 1.

1. Przygotowanie czynników wzrostu różnicowania komórek i innych odczynników
   1. Przygotowanie pożywki wolnej od ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC-SFM; patrz tabela materiałów) poprzez uzupełnienie zmodyfikowanego Eagle medium-F12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) suplementem hESC, 1,8% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1 mM 2-merkaptoetanolu.
   2. Przygotować 0,1% m/v roztwór żelatyny wieprzowej, rozpuszczając żelatynę w sterylnej wodzie. Roztwór żelatyny można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 lat.
   3. Przygotować roztwór podstawowy białka morfogenetycznego ludzkiej kości (BMP4) (25 μg/ml), rozpuszczając BMP4 w roztworze 4 mM chlorowodoru (HCl)-0,2% BSA PBS. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 50 μl podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku. Po rozmrożeniu BMP4 można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 5 dni.
   4. Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) (100 μg/ml), rozpuszczając VEGF w 0,2% roztworze PBS BSA. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 10 μl podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku. Po rozmrożeniu wywar VEGF można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 7 dni.
   5. Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego czynnika komórek macierzystych (SCF) (100 μg/ml), rozpuszczając SCF w 0,2% roztworze PBS BSA. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 5 μl podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku. Po rozmrożeniu wywar SCF można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 10 dni.
   6. Przygotować ludzki roztwór podstawowy interleukiny-3 (IL3) (10 μg/ml), rozpuszczając IL3 w 0,2% roztworze BSA PBS. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 500 μl podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 lat. Po rozmrożeniu zapas IL3 można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 15 dni.
   7. Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (CSF1) (10 μg/ml), rozpuszczając CSF1 w 0,2% roztworze PBS BSA. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 1 ml podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 lat. Po rozmrożeniu zapas CSF1 można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 15 dni.
2. Etap 1: Wytwarzanie ciał zarodkowych (dzień 0–dzień 3)
   1. W dniu 0 dodaj 2,25 ml pożywki etapu 1 (hESC-SFM uzupełniony 50 ng/ml BMP4, 50 ng/ml VEGF i 20 ng/ml SCF) do dwóch dołków 6-dołkowych płytek o ultraniskim przyłączeniu.
   2. Zastąp pożywkę konserwacyjną z jednej 80% zlewającej się studzienki iPSC w 6-dołkowej płytce na 1,5 ml pożywki etapu 1.
   3. Wyciąć kolonie za pomocą narzędzia do pasażowania komórek i przenieść wycięte kolonie za pomocą pipety do dwóch dołków 6-dołkowej płytki o ultraniskim nasadce (patrz Tabela materiałów).
   4. W 2. dniu doprowadź cytokiny do końcowego stężenia 50 ng/ml BMP4, 50 ng/ml VEGF i 20 ng/ml SCF za pomocą 0,5 ml pożywki hESC-SFM.
      nuta: Kolonie IPSC staną się EB (rysunek 2A).
3. Etap 2: Pojawienie się komórek krwiotwórczych w zawiesinie
   1. W dniu 4 pokryj 4 dołki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej 0,1% w/v żelatyny i inkubuj przez co najmniej 10 minut.
   2. Usuń żelatynę i dodaj 2,5 ml pożywki etapu 2 (X-VIVO15 uzupełniony 100 ng/ml CSF1, 25 ng/ml IL-3, 2 mM glutamax, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,055 mM 2-merkaptoetanolu).
   3. Zebrać uformowane EB do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i pozwolić im osiąść na dnie probówki pod wpływem grawitacji. Ostrożnie zassać nośnik.
   4. Ponownie zawiesić EB w 2 ml pożywki etapu 2.
   5. Przenieś 10-15 EB (nie więcej niż 15) do studzienki pokrytej żelatyną zawierającej 2,5 ml pożywki etapu 2.
   6. Inkubować EB w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ powietrza.
   7. Zmieniaj podłoża na platerowanych EB co 3-4 dni przez 2-3 tygodnie.
   8. Po 2-3 tygodniach EB zaczynają uwalniać nieprzylegające komórki krwiotwórcze do zawiesiny.
      nuta: Ten okres uwalniania komórek zawiesiny może się różnić i jest zależny od linii komórkowej. Komórki w tej zawiesinie mogą być zbierane i dojrzewać do postaci makrofagów (patrz etap 3) (ryc. 2A).
4. Etap 3: Końcowe dojrzewanie makrofagów
   1. Zebrać zawiesinę komórek krwiotwórczych i uzupełnić pożywkę (pożywkę etapu 2) na płytce EB.
   2. Odwirować komory zawiesiny przy 200 x g przez 3 min.
   3. Zawiesić komórki zawiesinowe w pożywce etapu 3 (X-VIVO15 uzupełniony 100 ng / ml CSF1, 2 mM glutamax i 1% penicyliny-streptomycyny).
   4. Płytki zebrane i odwirowane na nieprzetworzonych plastikowych płytkach bakteriologicznych o długości 10 cm (10 ml) lub niepowlekanych 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych (3 ml) o gęstości 0,2 x 10⁶ komórek/ml.
   5. Przechowuj komórki na pożywce etapu 3 przez 9–11 dni, zmieniając pożywkę co 5 dni.
      nuta: Kroki 1.4.1–1.4.5 z etapu 3 można powtarzać co 3–4 dni, a komórki zawiesiny można pobierać z oryginalnej płytki EB przez okres do 3 miesięcy.

Wyniki

Rycina 1: Graficzne podsumowanie różnicowania iPSC do dojrzałych funkcjonalnych makrofagów. Schemat narysowany za pomocą Biorenderu.

Rycina 2: Różnicowanie iPSC w kierunku makrofagów oraz liczby i morfologii iPSC-DM. (A) Obrazy Jasne...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CellMask Ciemnoczerwona plama błony plazmatycznej	Rybak termiczny	Zobacz materiał C10046	Pożywki do krioprezerwacji
Kriostor CS10	Sigma	Zobacz materiał C2874
Podłoże CTS CELLstart	Invitrogen	A1014201	Substrat komórek macierzystych
Żelatyna ze skóry świń	Sigma	Zobacz materiał G9136
Rekombinowane ludzkie białko BMP4	Prace badawczo-rozwojowe	314-BP-010
Rekombinowana ludzka IL3	Preprotech	Numer katalogowy: 0200-03-10
Rekombinowany ludzki MCSF (bez nośnika) 100ug	Legenda biologiczna	574806
Rekombinowane ludzkie białko VEGF	Prace badawczo-rozwojowe	293-VE-010
SCF (C-Kit Ligand) Rekombinowane białko ludzkie	Rybak termiczny	PHC2111
Trzon Pro hESC SFM	Rybak termiczny	A1000701
StemPro EZPassage Jednorazowe narzędzie do pasażowania komórek macierzystych	Rybak termiczny	23181010
Ultraniskie płytki mocujące: Płytka wielodołkowa do hodowli komórkowych, 6-dołkowa, powierzchnia odstraszająca komórki w kształcie gwiazdy	Greiner	Numer katalogowy: 657970
2-merkaptoetanol (50 mM)	Invitrogen	31350010
DPBS, wapń, magnez (500ml)	Rybak termiczny	14040091
Suplement GlutaMAX	Rybak termiczny	35050061