$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z modelami zwierzęcymi zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Zbierz DRG odcinka lędźwiowego od myszy eksperymentalnych
- Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwór roboczy ośrodka o gradiencie gęstości (np. Percoll), mieszając 9 objętości pożywki z 1 objętością Ca++/Mg++-free 10x HBSS. Trzymaj go na lodzie.
- Znieczulij mysz 2,5% Avertin. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone z powodu braku reakcji na uszczypnięcie tylnej łapy.
UWAGA: Wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy w wieku 6-8 tygodni.
- Przeprowadzić fuzję myszy przezsercowo z 10 ml wstępnie schłodzonego 1x PBS.
- Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach z czterema łapami zabezpieczonymi taśmą wewnątrz okapu oparów chemicznych. Podnieś skórę poniżej klatki piersiowej za pomocą kleszczy i wykonaj małe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić wątrobę i przeponę.
- Kontynuuj używanie nożyczek do przecinania przepony i klatki piersiowej oraz otwierania jamy opłucnej, aby odsłonić bijące serce.
- Szybko odetnij prawy uszek przedsionka nożyczkami do tęczówki. Po zauważeniu krwawienia włóż igłę 30 G do tylnego końca lewej komory i powoli wstrzyknij 10 ml wstępnie schłodzonego 1x PBS w celu perfuzji zwierzęcia.
- Wykonaj laminektomię grzbietową na myszy umieszczonej w pozycji leżącej.
nuta: Jeśli planowana jest hodowla komórkowa, przed nacięciem spryskaj mysz 70% etanolem i użyj wstępnie wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych do sekcji.
- Użyj skalpela w rozmiarze 11, aby wykonać jedno podłużne boczne głębokie nacięcie, zaczynając od okolicy piersiowej w dół do okolicy krzyżowej. Usuń skórę nożyczkami, aby odsłonić warstwę mięśni grzbietowych.
- Użyj Friedmana-Pearsona Rongeur, aby odkleić tkanki łączne i mięśnie, aż do odsłonięcia wyrostków kręgosłupa lędźwiowo-krzyżowego i obustronnych wyrostków poprzecznych.
- Użyj nożyczek Noyes Spring Scissor, aby ostrożnie otworzyć grzbietowy kręgosłup, a następnie przełącz się na Rongeur Friedmana-Pearsona, aby usunąć kości kręgów, aby odsłonić rdzeń kręgowy z nienaruszonymi nerwami rdzeniowymi.
- Ostrożnie wypreparuj ipsilateralny i przeciwległy DRG lędźwiowy (L4 / L5 DRG w naszym badaniu) i umieść go w 1 ml lodowatego lodu 1x HBSS wolnego od Ca + + / Mg ++ w homogenizatorze tkankowym Dounce. Teraz tkanki są gotowe do kroku 2.
nuta: Jeśli to możliwe, przyciąć nerw rdzeniowy przyczepiony do DRG.
2. Izoluj pojedyncze komórki od DRG lędźwiowego myszy
- Homogenizować tkankę DRG za pomocą luźnego tłuczka w homogenizatorze Dounce 20-25 razy.
- Umieść sterylne sitko nylonowe o pojemności 70 μm w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zwilż sitko komórkowe 800 μl lodowatego środka 1x HBSS, a przepływ jest zbierany w stożkowej probówce.
- Pobrać homogenizowaną zawiesinę tkankową z homogenizatora za pomocą pipety i przepuścić przez mokre sitko do komórek nylonowych o pojemności 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Przepłucz homogenizator dwukrotnie 800 μl lodowatego środka 1x HBSS, a następnie przelej go do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z sitkiem do komórek, aby zwiększyć wydajność.
- Dodać 1,5 ml zrównoważonej lodowatej pożywki o izotonicznym gradiencie gęstości (przygotowanej w kroku 1.1) do sterylnej probówki FACS o pojemności 5 ml z polistyrenu.
- Przenieść homogenat komórek z probówki stożkowej o pojemności 50 ml (w kroku 2.4) do probówki FACS i dobrze wymieszać z podłożem o gradiencie gęstości, pipetując w górę i w dół. Dodaj dodatkowe 500 μL 1x HBSS, aby uszczelnić górę.
- Granulować komórki przez odwirowanie przy 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie odessać supernatant zawierający mielinę w pożywce, nie naruszając osadu komórkowego na dnie probówki FACS.
- Zawiesić komórki w buforze PBS lub FACS zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do analizy FACS.
nuta: Oczekuje się, że co najmniej 50 000 do 100 000 komórek z L4 / L5 DRG jednej myszy.
- Ponownie zawiesić mechanicznie wyizolowane komórki DRG (L4/L5) w 100 μl PBS zawierającego 5% płodowej surowicy bydlęcej, a następnie inkubować z α-mysim przeciwciałem CX3CR1-APC (1:2 000) w ciemności w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
- Przemyć komórki jednorazowo 5 ml PBS; odwirować komórki 360 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
- Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 μl PBS do analizy FCAS. Jeśli planowane jest sortowanie komórek, zamiast tego ponownie zawieś komórki w buforze FACS.