Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Etapy chirurgicznego wycięcia i przygotowania tkanki:
- Chirurgiczne usunięcie jelita cienkiego (SI)
- Poddać myszy eutanazji za pomocą uduszenia CO2 lub innej równoważnej metody zatwierdzonej przez instytucjonalną komisję etyczną ds. zwierząt.
- Przenieś mysz do dedykowanego obszaru do chirurgicznego wycięcia. Połóż tylną stroną do dołu i zdezynfekuj brzuch 70% etanolem. Wykonaj laparotomię, przecinając skórę brzucha i otrzewną wzdłuż linii środkowej od łona do klatki piersiowej, otwierając w ten sposób jamę otrzewnej.
nuta: Pierwsze nacięcie należy wykonać na stosunkowo niewielkim obszarze skóry, aby uniknąć penetracji jamy otrzewnej i uszkodzenia tkanki jelitowej. Kontynuuj wycinanie aż do pożądanej granicy anatomicznej.
- Zidentyfikuj kątnicę, która jest idealnym punktem orientacyjnym do wykrywania końcowego odcinka jelita krętego, które stanowi dystalny odcinek jelita cienkiego.
nuta: Kątnica zwykle znajduje się w lewym dolnym rogu odwłoka myszy.
- Wskaż połączenie krętniczo-kątnicze i wykonaj nacięcie na tym poziomie tak dystalnie, jak to możliwe, aby oddzielić jelito cienkie od kątnicy. W kolejnych krokach unikaj nadmiernego kontaktu fizycznego ze ścianą jelita, ponieważ delikatne PP łatwo zapadają się pod dotykiem.
- Delikatnie usuń całe jelito cienkie aż do zwieracza odźwiernika, przecinając krezkę nożyczkami. Zidentyfikuj połączenie między odźwiernikiem a dwunastnicą i odetnij dwunastnicę na tym poziomie, co doprowadzi do całkowitego oderwania jelita cienkiego od jamy brzusznej.
UWAGA: (i) Unikaj nadmiernego wyprostu, ponieważ może to spowodować pęknięcie ściany jelita. (ii) Jeżeli oprócz limfocytów PP pożądana jest izolacja limfocytów LP, konieczne jest całkowite usunięcie tłuszczu krezkowego. Jednak tylko w przypadku izolacji PP pozostały tłuszcz krezkowy może przynieść pewne korzyści podczas dalszych etapów izolacji; Dlatego należy go zachować.
- Umieść odłączone jelito cienkie na 6-dołkowej płytce wypełnionej zimną RPMI + 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i delikatnie mieszaj tkanki ręcznie, aż wszystkie segmenty jelita zostaną zanurzone w zimnym podłożu. Utrzymuj tkanki na lodzie przez kolejne kroki.
- Po wypreparowaniu żądanej liczby mysich jelit cienkich przystąp do wycięcia PP z pobranego jelita cienkiego.
- Chirurgiczne wycięcie PP i przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej:
- Delikatnie przenieś jelito cienkie na ręcznik papierowy, chwytając tłuszcz krezkowy za pomocą kleszczy i kładąc stronę krezkową skierowaną w stronę ręcznika papierowego. Zwilż cały segment jelita zimnym RPMI + 10% FBS, aby uniknąć odwodnienia tkanek i lepkości.
nuta: Pozostały tłuszcz krezkowy może być pomocny na tym etapie, ponieważ segmenty tkanki tłuszczowej po krezkowej stronie SI będą przyklejać się do ręcznika papierowego, utrzymując stronę antykrezkową skierowaną do góry.
- Zidentyfikuj PPs, które pojawiają się jako białe, wielopłatkowe agregaty w kształcie "kalafiora" po stronie przeciwkrezkowej ściany jelita.
nuta: Wypłukiwanie zawartości światła nie jest zalecane, dopóki wszystkie PP nie zostaną wycięte. Opróżnienie zawartości luminalnej może spowodować zapadnięcie się PP i zapobiegnie kontrastowi kolorów między PP a ścianą jelita, co jest bardzo pomocne w wizualnej identyfikacji PP.
- Po zidentyfikowaniu PP po stronie antykrezkowej, umieść chirurgiczne nożyczki z zakrzywionym końcem na PP (krzywa powinna być skierowana do góry), ograniczając PP od jego dystalnej i bliższej granicy.
fakultatywny: Delikatnie popchnij PP w kierunku ostrzy nożyczek za pomocą opuszka palca. Ten manewr doprowadzi do lepszego wykluczenia otaczającej tkanki innej niż PP. Ostrożnie wyciąć PPs, wykluczając otaczającą tkankę jelitową.
UWAGA: (i) Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania maksymalnej wydajności komórek PP przy jednoczesnej minimalizacji zanieczyszczenia komórek z sąsiednich przedziałów jelitowych, takich jak LP i nabłonek jelitowy, które są również bogate w limfocyty T. (ii) Z jednego SI wyciętego z myszy C57BL/6 można zebrać 5-10 PP (średniej wielkości, wielopłatkowych). Dążąc do jeszcze mniejszych PP (nie wielopłatkowych), możliwe jest zebranie do 12-13 PP na mysz (C57BL/6) przy użyciu tego protokołu.
- Przenieś wycięte PP na 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej wypełnioną lodowatym RPMI + 10% FBS i utrzymuj na lodzie za pomocą kleszczy lub zakrzywionych nożyczek chirurgicznych.
UWAGA: (i) Bezpośrednio po wycięciu PP śluz i treść jelitową na powierzchni PP można oczyścić, delikatnie pocierając tkankę o ręcznik papierowy. Ten krok pomoże poprawić żywotność limfocytów PP. (ii) Zamiast przenoszenia PP na płytkę, można również rozważyć przeniesienie do oddzielnych probówek w zależności od całkowitej liczby próbki.
- Opcjonalnie: Po zakończeniu wycinania PP i późniejszego umieszczania w płytce studzienki, liczbę i rozmiar PP pobranych z różnych grup eksperymentalnych/mysich można udokumentować poprzez wykonanie zdjęcia płytki do hodowli tkankowej zawierającej PPs.
- Przygotuj zestaw stożkowych probówek o pojemności 50 ml wypełnionych 25 ml RPMI + 10% FBS (wstępnie podgrzanych w temperaturze 37 °C). Za pomocą nożyczek odetnij krawędź końcówki o pojemności 1 000 μl z odległości, która pozwoli na aspirację PP za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Odessać PP za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przenieść je z 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej do przygotowanych stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
nuta: Użyj nowej końcówki dla każdej próbki myszy, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami.
- Zabezpiecz pokrywę i umieść probówki pionowo w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C, z ciągłym mieszaniem przy 125–150 obr./min przez 10 minut. W międzyczasie przygotuj nowy zestaw probówek o pojemności 50 ml i umieść sitko o pojemności 40 μm na górze każdej probówki, przez które zostanie przygotowana zawiesina pojedynczych komórek.
UWAGA: (i) Etap mieszania usunie pozostałą zawartość jelitową, śluz i resztki komórek, które zmniejszają żywotność komórek i regenerację limfocytów PP, jeśli nie zostaną usunięte. (ii) Nie stosuj żadnych enzymów trawiennych na tkankę PP, ponieważ proces trawienia powoduje dramatyczną utratę ekspresji CXCR5 z powierzchni komórki.
- Po wymieszaniu przenieś PP do sitka komórkowego 40 μm umieszczonego na wierzchu nowo przygotowanych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Używając zaokrąglonej strony tłoka strzykawki o pojemności 10 ml, delikatnie przebić PP przez sitko do komórek, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową. Przepłucz sitko 15–20 ml zimnego RPMI + 10 % FBS.
UWAGA: (i) Przed filtrowaniem należy potrząsnąć rurkami zawierającymi PP poziomo. To krótkie potrząsanie ułatwi przenoszenie PP do filtrów komórkowych. (ii) Zaleca się stosowanie sitka komórkowego o wielkości 70 μm do izolacji nielimfoidalnych komórek odpornościowych (np. monocytów, makrofagów, DC).
- Odwirować zawiesiny jednokomórkowe w temperaturze 350–400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 10 x 106 komórek/ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru.