Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z ludzkich płaszczy kożucha

Streszczenie

Źródło: Mily, A., et al. Polaryzacja ludzkich komórek pochodzących z monocytów M1 i M2 oraz analiza za pomocą cytometrii przepływowej po zakażeniu Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie pokazujemy izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, PBMC, zawierających monocyty i limfocyty z ludzkiej kożuchy przez wirowanie w gradicynacji gęstości. Wyizolowane PBMC można wykorzystać do dalszej analizy.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Przygotowanie mediów

UWAGA: Szczegóły dotyczące wszystkich odczynników i materiałów eksploatacyjnych znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Kompletna pożywka RPMI: Uzupełnij RPMI 1640 o 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 10 mM HEPES i 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Unikaj antybiotyków w pożywce do hodowli komórkowych podczas pracy z infekcją Mtb.
2. Pożywka RPMI bez surowicy: Uzupełnij RPMI 1640 o 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy i 10 mM HEPES.

2. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z kożuchów

UWAGA: Wykonuj wszystkie prace z ludzką krwią (potencjalnie zakaźną) w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Dezaktywuj resztki produktów krwiopochodnych środkami dezynfekującymi przez 15 minut przed wyrzuceniem. W tym przypadku krew pobrano od zdrowych ochotników. Ten protokół różnicowania makrofagów in vitro został opracowany tak, aby obejmował 10 x 10⁶ izolowanych PBMC / dawcę / studzienkę. Od każdego dawcy jedna otoczka kożuchowa zawiera około 50 ml skoncentrowanej zawiesiny leukocytów pochodzącej z krwi pełnej, która zwykle dostarcza 500–800 x 10⁶ PBMC, z których można pobrać około 10% lub 50–80 x 10⁶ monocytów.

1. Załaduj 15 ml krwi w kożuchie na 15 ml pożywki o gradiencie gęstości przygotowanej w probówce o pojemności 50 ml. Powoli nakładaj krew na warstwę gradientu gęstości, opierając końcówkę pipety o ściankę probówki.
2. Obracaj rurki przy 600 x g przez 25 minut w temperaturze pokojowej (RT) z 0 przyspieszeniem i 0 opóźnieniem.
   nuta: Dokładnie zamknij pokrywki przed wirowaniem i zawsze sprawdzaj uchwyty probówek pod kątem potencjalnego rozlania się po odwirowaniu.
3. Usunąć górną warstwę osocza za pomocą sterylnej pipety Pasteura, a następnie ostrożnie zebrać warstwę komórek jednojądrzastych do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Dodaj pożywkę RPMI bez surowicy do granulki PBMC, aby uzyskać końcową objętość 50 ml. Dokładnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę przed odwirowaniem przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy, obracając spód probówki w palcach.
5. Aby usunąć zanieczyszczenie pożywką o gradiencie gęstości z PBMC, należy przemyć komórki 2-3 razy za pomocą RPMI bez surowicy, aby uzyskać końcową objętość 50 ml. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Myć do momentu, aż supernatant komórek stanie się przezroczysty.
6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 20 ml pożywki RPMI bez surowicy.
7. Policz komórki za pomocą barwienia trypanem niebieskim, ręcznie za pomocą hemocytometru lub za pomocą automatycznego licznika komórek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w błękitu trypanowym w rozcieńczeniu 1:2 lub 1:10, mieszając próbkę błękitu trypanowego komórkowego na 96-dołkowej płytce, np. 50 μl + 50 μl (do liczenia hemocytometru) lub 10 μl + 10 μl (do automatycznego zliczania komórek) i policzyć komórki, aby uzyskać liczbę żywych komórek/ml.
   ostrożność: Błękit trypanowy jest toksyczny i należy go wyrzucić do oddzielnych odpadów chemicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Preparat limfatyczny	Alere Technologies AS	11508545
Silnik RPMI 1640	Korporacja Technologii Życiowych	SH30096.01
EDTA (0,5 mln)	Szpital Uniwersytecki Karolinska, Huddinge	N/a
Na-pirogronian	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	SH300239.01
L-glutamina	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	SH30034.01
HEPESY	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	SH30237.01
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524

powiedział: