$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Różnicowanie i polaryzacja komórek pochodzących z monocytów
- Do izolacji monocytów należy stosować przyleganie z tworzywa sztucznego. Krótko wysiać świeżo wyizolowane jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) na 6-dołkowej płytce hodowlanej o odpowiednim stężeniu, np. 10 x 106 PBMC/basenik w 2 ml pożywki RPMI bez surowicy (uzupełnić RPMI 1640 1 mM pirogronian sodu, 2 mM L-glutaminy i 10 mM HEPES) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Po 2-3 godzinach usunąć nieprzylegające komórki za pomocą pipety i przemyć studzienki 3 razy 1 ml pożywki bez surowicy. Przyłączone komórki są monocytami i stanowią około 10% wszystkich PBMC dodanych do studzienki, tj. 106 monocytów pobranych z 10 x 106 PBMC dodanych na studzienkę.
- W celu różnicowania makrofagów należy przygotować roztwór roboczy zawierający 50 ng/mL GM-CSF lub M-CSF do polaryzacji makrofagów M1 i M2, dodany do 2 ml kompletnej pożywki RPMI na studzienkę. Hodować komórki w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 3 dni.
- W dniu 3 ostrożnie usunąć 1 ml pożywki do hodowli komórkowych z górnej warstwy każdej studzienki i uzupełnić kultury komórkowe 1 ml świeżej kompletnej pożywki RPMI zawierającej podwójne stężenie M-CSF lub GM-CSF, aby uzyskać końcowe stężenie 50 ng/ml w studzienkach. Dodaj czynniki wzrostu w gotowym roztworze roboczym o stężeniu 100 ng / ml / studzienkę.
- W dniu 6 dodaj różne bodźce przez ostatnie 18-20 godzin różnicowania komórek, aby uzyskać w pełni spolaryzowany i dojrzały M1 (interferon-γ; IFN-γ i lipopolisacharyd; LPS (E. coli O55:B5)) lub M2 (interleukina 4; IL-4) makrofagi. Do polaryzacji M1 przygotuj IFN-γ i LPS w kompletnym pożywce RPMI (Uzupełnij RPMI 1640 1 mM pirogronianem sodu, 2 mM L-glutaminą, 10 mM HEPES i 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS)) i dodaj 50 μl na studzienkę, aby uzyskać końcowe stężenie 50 ng / ml IFN-γ i 10 ng / ml LPS w hodowlach komórkowych. Do polaryzacji M2 przygotuj IL-4 w kompletnym pożywce RPMI i dodaj 50 μl na studzienkę, aby uzyskać końcowe stężenie 20 ng / ml w kulturach komórkowych.
- W celu różnicowania makrofagów spolaryzowanych M0 należy stymulować komórki tylko M-CSF, bez żadnych dodatkowych cytokin (zapewniając fenotyp podobny do M2).
- Regularnie sprawdzaj morfologię kultur komórkowych pochodzących z monocytów za pomocą mikroskopii świetlnej, aby upewnić się, że mniejsze monocyty różnicują się w większe komórki podobne do makrofagów. Monitoruj również potencjalne różnice morfologiczne między polaryzacją M1 i M2, tj. wydłużone i rozciągnięte komórki M1 w porównaniu z komórkami M2 o bardziej zaokrąglonym kształcie.