Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie ogniw zasilających AC-6
Uwaga: Linia komórek zrębowych AC-6.21 (w skrócie AC-6) (dostarczona przez I. Weissmana, Uniwersytet Stanforda) powinna być utrzymywana w RPMI uzupełniona 15% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). Aby służyć jako komórki zasilające, komórki AC-6 są γ napromieniowywane 3,000 rad (30Gy) na dzień przed kokulturą, aby zapobiec ich proliferacji. Należy zauważyć, że komórki AC-6 mają tendencję do utraty zdolności do różnicowania, jeśli są przepełnione podczas konserwacji lub jeśli ich liczba przejścia przekracza 20.
- Umyj komórki AC-6 raz 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco i usuń DPBS przez aspirację. Traktować komórki AC-6 0,8 ml roztworu trypsyny (0,05% trypsyny i 0,5 mM EDTA w DPBS) przez 3-5 minut w temperaturze 37oC, 5% CO2 , a następnie zatrzymać reakcję, rozcieńczając ją 10 objętościami pożywki hodowlanej w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
- Wysiewać komórki AC-6 w 4 komórkach / basenie 5,9x10 na płytki 12-dołkowe i inkubować je w temperaturze 37oC, 5% CO2 O/N.
nuta: Gęstość ogniw AC-6 jest bardzo ważna, ponieważ niższa gęstość będzie sprzyjać wytwarzaniu prądu stałego. Wysiew o gęstości 5,9x104 komórek/studzienkę pozwoli AC-6 osiągnąć konfluencję do następnego dnia, co jest optymalne dla wyprowadzenia pDC z CLP.
- Naświetlić ogniwa AC-6 o natężeniu 3,000 rad (30 Gy) za pomocą γ-naświetlacza.
Uwaga: Dawka stosowana do napromieniania AC-6 jest zoptymalizowana, aby zapobiec proliferacji komórek, a jednocześnie utrzymać je przy życiu wystarczająco długo, aby zapewnić cytokiny i kontakt komórka-komórka wymagane do różnicowania DC od CLP.
- Odessać pożywkę i zastąpić 1 ml pełnego RPMI (RPMI z 10% inaktywowanym termicznie FBS, 50 μg/ml gentamycyny i 50 μM β-merkaptoetanolu).
2. Izolowanie komórek BM od myszy
- Ofiarować myszy przez uduszenie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy. Umieść myszy na tacy do sekcji i wysterylizuj je 70% etanolem. Wykonaj nacięcie w środkowej części brzucha i usuń skórę z dystalnej części myszy, w tym skórę pokrywającą kończyny dolne.
- Wypreparuj myszy w półsterylnym kapturze. Aby uwolnić kość udową i piszczelową, przypnij kość udową powyżej, a piszczele poniżej stawu kolanowego. Odłącz mięśnie od kości za pomocą nożyczek i umieść kości na 6-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 5 ml pełnego RPMI.
- Przenieś się do sterylnego kaptura hodowlanego. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml podłączoną do igły 27G pełnym RPMI. Odetnij oba końce kości za pomocą nożyczek i włóż igłę 27G, aby wypłukać szpik z kości, delikatnie wstrzykując pełne RPMI raz z każdego końca.
- Przygotować zawiesinę jednokomórkową, delikatnie pipetując komórki w górę i w dół 3-5 razy w naczyniu hodowlanym za pomocą strzykawki bez igły.
- Odwirować komórki przez 5 minut przy 500 x g i zdekantować supernatant.
- Lizować krwinki czerwone za pomocą 1 ml buforu ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) inkubować przez 1 minutę i zatrzymać reakcję przez rozcieńczenie 10 objętościami pełnego RPMI. Pozostaw komórki na 5 minut, aby grawitacyjnie rozdrobnić martwe grudki komórek i resztki tkanek.
nuta: Nie stój dłużej niż 5 minut, ponieważ spowoduje to utratę komórek z powodu osiadania żywych komórek.
- Powoli zdekantować supernatant zawierający komórki do nowej probówki, pozostawiając zanieczyszczenia w oryginalnej probówce.
- Wirować przez 5 minut przy 500 x g w celu osadzenia komórek, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant.
- Ponownie zawiesić całkowitą liczbę komórek BM (zwykle 4-6 x 107 komórek BM uzyskuje się z jednej myszy) w buforze FACS o pojemności 100 μl (1x PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA).
3. Analiza FACS i sortowanie CLP
- Dodaj anty-CD16/32 (klon hybrydoma supernant 2,4G2, 50 μl/reakcję lub 1-2 μg/reakcję) do komórek w buforze FACS (krok 2.9) na 1-2 minuty w celu zablokowania receptorów Fc.
nuta: Anty-CD16/32 jest również nazywany blokiem Fc, który jest dodawany, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z komórkami eksprymującymi receptory Fc, w tym granulocytami, monocytami i limfocytami B.
- Jednocześnie barwić komórki następującymi przeciwciałami znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym (dla komórek 4x107) przez 15 minut na lodzie, unikając światła otoczenia. Przeciwciała: markery linii sprzężone z PE (po 0,2 μg), w tym anty-CD3 (17A2), anty-CD8 (53-6.). 7), anty-B220 (RA3-6B2), anty-CD19 (eBio1D3), anty-CD11b (M1/70), anty-Gr-1 (RB6-8C5), anty-Thy1.1 (HIS51), anty-NK1.1 (PK136), anty-TER119 (TER-119) i anty-MHC-II (NIMR-4), 0,2 μg anty-c-Kit-PerCP-Cy5,5 (2B8), 1 μg anty-Sca-1-FITC (D7), 0,4 μg anty-M-CSFR-APC (AFS98) i 0,2 μg anty-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Przemyć komórki 3 ml buforu FACS i odwirować przez 5 minut przy 500 x g.
- Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 300 μl i przefiltrować komórki przez sitko o pojemności 40 μM.
- Przemyć probówkę dodatkowym buforem FACS o pojemności 100 μl w celu odzyskania pozostałych komórek i przefiltrować do sterylnej probówki sortującej FACS przy użyciu tego samego sitka do komórek.
- Analizę cytometryczną przepływową należy przeprowadzić natychmiast po barwieniu, używając odpowiednich filtrów i napięć do wykrywania sygnału. Użyj lasera o długości fali 488 nm do wykrycia przeciwciał znakowanych FITC, PerCP-Cy5.5, lasera o długości fali 561 nm do wykrycia przeciwciał znakowanych PE i PE-Cy7 oraz lasera o długości fali 633 nm do wykrycia przeciwciała znakowanego APC.
- Posortuj CLP według następujących znaczników: lin-c-kit,int, Sca-1,int, M-CSFR-IL-7Rα+ (zgodnie z zabarwieniem w kroku 3.2), korzystając z sortera komórek. Zebrać posortowane komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml pełnego RPMI jako poduszkę.
- Zapisz bezwzględną liczbę posortowanych komórek, jak pokazano przez sortownik komórek na końcu przebiegu. Zazwyczaj 5x104 CLP można uzyskać z BM jednej myszy.
4. Coculture CLP i AC-6
- Odwirować posortowane komórki z kroku 3.7 przez 10 minut przy 500 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z wystarczającą ilością pełnego RPMI, aby uzyskać gęstość komórek około 5x104 komórek/ml. Wysiać 500 komórek/studzienkę na 12-dołkowej płytce zawierającej komórki zasilające przygotowanej w kroku 1.4.
- Dodać 100 ng/ml FL (hu-Flt3L-Ig wytwarzany we własnym zakresie przy użyciu systemu ekspresji dostarczonego przez M. Manz, Szpital Uniwersytecki w Zurychu, Szwajcaria) i inkubować w temperaturze 37oC, 5% CO2 z okresowym wizualnym monitorowaniem rozwoju prądu stałego pod mikroskopem.
nuta: Dostępny na rynku rekombinowany ludzki FL lub mysi FL może być stosowany jako substytut hu-Flt3L-Ig w celu wsparcia rozwoju prądu stałego.
- Zebrać komórki w supernatance w dniu 12 i przemyć studzienki raz 0,5 ml kompletnej pożywki RPMI, łączącej otrzymane supernatanty. Dodać 0,5 ml świeżej pożywki i zeskrobać przylegające komórki za pomocą skrobaka do komórek.
- Połączyć pożywkę zawierającą komórki z obu części i wirować przez 5 minut przy 500 x g.
- Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 50 μl. Dodać 50 μl supernatantu hybrydoma anty-CD16/32 i inkubować przez 1-2 minuty w celu zablokowania receptorów Fc.
- Wylicz i wybarwij wszystkie komórki następującymi przeciwciałami (po 0,05 μg każda): anty-CD11c-APC (N418), anty-CD11b-FITC i anty-B220-PE.
- Umyć i odwirować komórki zgodnie z opisem w kroku 3.3.
- Ponownie zawieś komórki w buforze FACS 100 μl, bramkuj na CD11c+ i przeanalizuj pod kątem cDC (CD11c+CD11b+B220-) i pDC (CD11c+CD11b-B220+).