Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs)
- Przygotowanie odczynnika
- Przygotować PBS/EDTA: buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) i uzupełnić 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Wysterylizuj ten roztwór, filtrując przez filtr 0,2 μm. UWAGA Aby przed użyciem przechowywać PBS/EDTA w temperaturze 4 °C i ogrzać do temperatury pokojowej.
- Przygotować bufor barwiący: roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Wysterylizuj ten roztwór, filtrując przez filtr 0,2 μm.
- Zbierz krew z Blood Cone
nuta: Stożek krwi zawiera składniki białych krwinek pobrane ze szpitala po płytkach krwi. Jeśli krew jest zbierana w probówkach z heparyną lub EDTA, rozcieńczyć krew PBS w stosunku 1:1 i przejść do kroku 1.3; jeśli otrzymany jest płaszcz buffy, rozcieńczyć kożuchy z PBS w stosunku 1:2 i przejść do kroku 1.3.
- Odetnij dwa końce stożka, aby krew mogła wypłynąć do probówki o pojemności 50 ml.
Należy pamiętać, że stożek zawiera zwykle 10 ml krwi.
- Za pomocą strzykawki z końcem zawierającej 30 ml PBS/EDTA umyć stożek i zebrać go do probówki o pojemności 50 ml.
- Rozcieńczyć krew dalej za pomocą PBS/EDTA do końcowej objętości 80 ml.
- Izolacja PBMC przez wirowanie gęstości
- Podamy po 15 ml Ficollu do 4 świeżych probówek o pojemności 50 ml.
- Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml dodać 20 ml rozcieńczonej krwi na warstwę Ficollu. Zwróć uwagę, aby trzymać probówkę o pojemności 50 ml pod kątem 45 i uważać, aby nie zakłócić interfazy.
- Odwirować probówki o stężeniu 805 x g bez hamulców przez 30 minut, 20 °C.
- Usunąć warstwę plazmy i zebrać pierścień PBMC leżący tuż pod warstwą plazmy za pomocą pipety Pasteura. Połączyć cztery probówki PBMC w dwie probówki o pojemności 50 ml. Należy pamiętać, aby unikać zbierania przezroczystej warstwy poniżej PBMC.
- Dodać PBS/EDTA do końcowej objętości 50 ml na probówkę PBMC i odwirować przy 548 x g z hamulcami przez 10 minut, 20 °C.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w każdej probówce z 25 ml buforu barwiącego i połączyć w jedną probówkę o pojemności 50 ml.
- Wirować przy 367 x g z hamulcami przez 5 min, 4 °C.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad z 10 ml buforu barwiącego.
2. Wzbogacanie monocytów przez separację magnetyczną
- Określ numer komórki
- Weź 20 μl zawiesiny komórek PBMC i wymieszaj ją z 20 μl błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę żywych komórek za pomocą cytometru.
- Zawiesina komory wirówki przy 367 x g z hamulcami przez 10 min, 4 °C.
- Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy do stężenia 10-7 komórek na 80 μl buforu barwiącyego.
- Etykietowanie magnetyczne
- Dodać 20 μl mikrogranulek CD14 na 107 komórek, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 2 - 8 °C.
- Przemyć komórki, dodając 1 ml buforu barwiącego na10-7 komórek i odwirować przy 367 x g z przerwami przez 10 minut, 4 °C.
- Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w stężeniu 10-7 komórek na 50 μl buforu barwiącego.
- Separacja magnetyczna
- Użyj kolumny średniej wielkości, aby uzyskać maksymalnie 2 x 108 komórek.
nuta: Wybierz odpowiednią kolumnę i separator zgodnie z całkowitą liczbą komórek i liczbą komórek CD14+ zalecaną w arkuszu danych.
- Umieścić kolumnę w polu magnetycznym odpowiedniego separatora i przygotować kolumnę, przepłukując ją 500 μl buforu barwiącego.
- Zawiesinę komórek należy pipetować na kolumnę i zebrać nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę, za pomocą probówki o pojemności 15 ml.
- Załóż nową probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną i przemyj kolumnę 3 razy 500 μl buforu barwiącego. Upewnij się, że zbiornik kolumny jest pusty przed dodaniem nowego buforu barwiącego między praniami.
- Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na świeżej probówce o pojemności 15 ml.
- Odpipetować 1 ml buforu barwiącego na kolumnę. Natychmiast wypłucz magnetycznie oznakowane ogniwa, mocno wciskając tłok (dostarczony w zestawie) do kolumny.
- Powtórz kroki od 2.3.2 do 2.3.6, używając eluowanej frakcji na nowej kolumnie, aby zwiększyć czystość komórek CD14+. Należy pamiętać, że kulki zostaną automatycznie uwolnione z komórek w hodowli podczas kroku 3.2.
3. Różnicowanie komórek dendrytycznych do różnych stanów aktywacji
- Przygotowanie odczynnika (poziom endotoksyny musi być mniejszy niż 0,1 EU/ml we wszystkich odczynnikach)
- Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych: RPMI 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% aminokwasami endogennymi (NEAA) i 0,05 mM 2-merkaptoetanolem (2ME). Wysterylizuj ten roztwór, filtrując przez filtr 0,2 μm.
- Przygotować cytokiny: rozpuścić IL-4 i GM-CSF w wodzie klasy do hodowli komórkowych odpowiednio do stężenia 0,25 mg/ml w warunkach aseptycznych. Podwielokrotne cytokiny rozmieścić w probówkach mikrowirówek o pojemności 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Przygotować zapas witaminy D3: rozpuścić witaminę D3 w wodzie klasy do hodowli komórkowych do stężenia 100 mM w warunkach aseptycznych. Witaminę D3 rozlać do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotować zapas deksametazonu: rozpuścić deksametazon w wodzie przeznaczonej do hodowli komórkowych do stężenia 10 mM w warunkach aseptycznych. Porcję deksametazonu rozlać do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotować LPS: rozpuścić lipopolisacharydy (LPS) w wodzie przeznaczonej do hodowli komórkowych do stężenia 1 mg/ml w warunkach aseptycznych. Porcję LPS rozlać do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Generowanie różnych moDC
- Wysiew: 4 zestawy monocytów CD14+ w stężeniu 0,3 - 0,5 x 106/ml pożywki do hodowli komórkowych uzupełnionej 200 ng/ml GM-CSF i 200 ng/ml IL-4 w płytkach 6-dołkowych. Należy pamiętać, że jest to Dzień 0, a objętość pożywki w każdym 6 dołkach wynosi 2 ml.
- Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Usunąć 850 μl pożywki z kultury w dniu 4 i odwirować przy 300 x g przez 5 minut, 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 2 razy (200 ng/ml GM-CSF i 200 ng/ml IL-4). Dodaj tę mieszaninę komórek z powrotem do hodowli. Należy pamiętać, że stężenie 2x dodane dla GM-CSF i IL-4 zmieni się na 1x, gdy 1 ml pożywki zostanie ponownie dodany do kultury.
- Dodaj 1 μl bulionu witaminy D3 i 1 μl wywaru deksametazonu na ml pożywki do dwóch zestawów w dniu 5, aby wytworzyć tolerogenne moDC. Należy pamiętać, że końcowe stężenie witaminy D3 wynosi 100 nM, a deksametazonu 10 nM; dodanie GM-CSF i IL-4 nie jest wymagane w dniu 5.
- Dodać 200 ng/ml GM-CSF i 200 ng/ml IL-4 do wszystkich zestawów w dniu 6.
- Dodaj 1 μg/ml LPS do jednego z zestawów traktowanych tylko GM-CSF i IL-4 w dniu 6, aby wytworzyć dojrzałe moDC.
- Dodać 1 μg/ml LPS do jednego zestawu tolerogennych moDC w dniu 6, aby wytworzyć tolerogenne moDC.
- Zbierz różne rodzaje moDC w dniu 7, przepłukując szalkę hodowlaną PBS, EDTA do cytometrii przepływowej lub innych badań. Należy pamiętać, że zbierane są tylko nieprzylegające komórki. Należy pamiętać, że procentowa wydajność monocytów CD14 + dla niedojrzałych moDC, dojrzałych moDC, tolerogennych moDC i tolerogennych DC tolerogennych LPS wynosi odpowiednio około 90%, 50%, 60% i 60% i różni się w zależności od dawców krwi i partii FBS.
