Izolacja i oczyszczanie limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej

Streszczenie

Źródło: Tzeng, S. J. Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich komórek B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej. J. Vis. Exp. (2016)

W tym filmie pokazujemy izolację limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej za pomocą biotynylowanych przeciwciał specyficznych dla komórek innych niż B oraz mikrokulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Izolacja i oczyszczanie ludzkich komórek B krwi obwodowej

1. Pobrać ~ 10 ml krwi z żyły łokciowej środkowej (w dole łokciowym przed łokciem) do 15-mililitrowej probówki zawierającej_K2EDTA(1,5 do 2,0 mg/ml krwi) i natychmiast kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów.
2. Dodać 35 ml autoklawizowanego (121 °C, 15 min) buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ i 1 mM EDTA; pH 7,4) do probówki zawierającej świeżą próbkę krwi (≥ 3:1 obj./obj.) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) nie dłużej niż 5 min.
   nuta: Pojawienie się przepuszczalności światła przez rurkę wskazuje na zakończenie lizy RBC.
3. Wirować przy 600 x g przy RT przez 5 minut. Upewnij się, że osad ma biały kolor.
4. Zawiesić osad w 10 ml autoklawowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄ i 1,47 mM KH₂PO₄; pH 7,4) i odwirować jak w kroku 1.3.
5. Wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad z 10 ml pożywki RPMI 1640 (dodatki: 10% płodowej surowicy cielęcej, 100 μg/ml penicyliny/streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 2 mM L-glutaminy), a następnie umieść komórki w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym (10 ml krwi na szalkę). Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ na 30 minut.
6. Delikatnie zakręć naczyniem hodowlanym kilka razy i umieść pożywkę hodowlaną (komórki zawiesinowe) w plastikowych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Wyrzuć przylegające komórki (głównie makrofagi) na szalkach hodowlanych.
7. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
8. Zawiesić osad z 1 ml pożywki RPMI 1640. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
   nuta: Żywotność izolowanych leukocytów jest zwykle większa niż 90% przez wykluczenie błękitu trypanowego.
9. Odwirować jak w kroku 1.7 i ponownie zawiesić komórki w ~ 200 μl zimnego buforu PBS (0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA) w stężeniu 5 - 10 x 10⁶ komórek/ml.
10. Dodać 5 μl biotynylowanego anty-ludzkiego koktajlu Ab specyficznego dla komórek krwi (dla negatywnej selekcji komórek B) na 10⁶ komórek i inkubować na lodzie przez 30 min.
    nuta: Anty-ludzki koktajl Ab powinien zawierać co najmniej Abs specyficzne dla CD2 (lub CD3), CD14 i CD16.
11. Dodać 10-krotny nadmiar sterylnego PBS do komórek, odwirować przy 600 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
12. Dodać równe ilości mikrogranulek sprzężonych ze streptawidyną (5 μl na^10-6 komórek) do osadu i dokładnie wymieszać.
13. Inkubować na lodzie przez 30 minut w plastikowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
14. Dodać 2 ml buforu PBS do probówki.
15. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 8 minut. Brązowe mikrokulki będą stopniowo przyczepiać się do ścianki rurki obok magnesu.
16. Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie przenieś supernatant do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
17. Powtórz kroki od 1.14 do 1.16 i połącz dwa supernatanty, które zawierają nietknięte limfocyty B. Wyrzuć mikrogranulki.
18. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
19. Ponownie zawiesić granulkę w podłożu RPMI 1640 w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów.
    nuta: Zazwyczaj można wyizolować 1 - 5 x 10⁵ komórek B o czystości większej niż 95% z 10 ml krwi obwodowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odkurzacz BD K2E	BD Nauki biologiczne	367525	Tubka 10 ml
Ficoll-Paque Plus	GE Opieka zdrowotna	17-1440-02	Nie zawiera endotoksyn
Błękit trypanowy 0,5% roztwór	Przemysł biologiczny	03-102-1B	barwnik
IMag Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów B	BD Nauki biologiczne	558007	Odczynnik
Mikrokulki magnetyczne streptawidyny	BD Nauki biologiczne	9000810	Odczynnik
Probówki Falcon 15 ml	BD Sokół	352196	Wyroby z tworzyw sztucznych
Biotynylowany mAb CD27	Legenda biologiczna	302804	Klon O323
Biotynylowany anty-ludzki CD27	Legenda biologiczna	302804	Klon O323
Biotynylowany anty-ludzki CD27	eBionauka	Numer katalogowy: 13-0279-80	Klon O323