$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Sortowanie komórek dla zbioru naiwnych komórek B, komórek B pamięci i plazmablasów/komórek plazmatycznych (PBs/PCs)
- Używając oczyszczonych ludzkich komórek B krwi obwodowej, określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
- Ponownie zawiesić komórki w zimnym buforze PBS w stężeniu10-7 na ml w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml.
- Dodać 1 - 2 μg ludzkiej IgG na10-6 komórek i inkubować na lodzie przez 10 minut w celu uzyskania bloku Fc.
- Dodać po 1 μg anty-CD19-APC (klon: HIB19), anty-CD27-eFluor450 (klon: O323) i anty-CD38-PE (klon: HIT2) na 106 komórek; dobrze wymieszać i inkubować na lodzie przez 30 min.
- W ciągu ostatnich 5 minut w kroku 1.4 dodaj 5 μl dostępnej na rynku 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD).
- Dodać 2 ml PBS do probówki, wirować i wirować przy 600 x g przez 5 minut.
- Ponownie zawiesić komórki w buforze sortującym (sterylny PBS z 2% BSA i 2 mM EDTA) w stężeniu 1 - 5 x 10 7 komórek na ml w probówce o pojemności 15 ml.
- Przefiltruj komórki przez sitko z nylonowej siatki (rozmiar porów 40 μm), aby wyeliminować grudki komórek.
- Oddziel komórki za pomocą sortera cytometrycznego przepływowego wyposażonego w trzy lasery: fioletowy (405 nm), niebieski (488 nm) i czerwony (640 nm).
UWAGA: Sam niebieski laser jest wystarczający do 3-kolorowej cytometrii przepływowej.
- Posortuj komórki do trzech probówek o pojemności 15 ml (zawierających 5 ml pożywki RPMI) w celu jednoczesnego zbierania naiwnych komórek B (CD19 + CD27-), komórek B pamięci (CD19 + CD27 +) i PB / PC (CD19 + CD27 + / hiCD38 +).
nuta: Posortowane naiwne i pamięciowe limfocyty B mogą być dalej hodowane.