Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
Ludzka krew obwodowa musi być pobierana od zdrowych dawców za świadomą zgodą, a użycie próbek krwi musi być zgodne z zatwierdzonymi wytycznymi ustalonymi przez komisje rewizyjne. W tym badaniu przedstawiono protokół wykorzystania ludzkiej krwi w demonstracji wyników cytometrii przepływowej (ryc. 1) i testów ELISpot (ryc. 2).
1. Izolacja i oczyszczanie ludzkich komórek B krwi obwodowej
- Pobrać ~ 10 ml krwi z żyły łokciowej środkowej (w dole łokciowym przed łokciem) do 15-mililitrowej probówki zawierającejK2EDTA(1,5 do 2,0 mg/ml krwi) i natychmiast kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów.
- Dodać 35 ml autoklawowanego (121 °C, 15 min) buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) (150 mM NH4Cl, 10 mMKHCO3 i 1 mM EDTA; pH 7,4) do probówki zawierającej świeżą próbkę krwi (≥ 3:1 obj./obj.) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) nie dłużej niż 5 min.
nuta: Pojawienie się przepuszczalności światła przez rurkę wskazuje na zakończenie lizy RBC.
- Wirować przy 600 x g przy RT przez 5 minut. Upewnij się, że osad ma biały kolor.
- Zawiesić osad w 10 ml autoklawowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 i 1,47 mM KH2PO4; pH 7,4) i odwirować jak w kroku 1.3.
- Wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad z 10 ml pożywki RPMI 1640 (dodatki: 10% płodowej surowicy cielęcej, 100 μg/ml penicyliny/streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 2 mM L-glutaminy), a następnie umieść komórki w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym (10 ml krwi na szalkę). Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 30 minut.
- Delikatnie zakręć naczyniem hodowlanym kilka razy i umieść pożywkę hodowlaną (komórki zawiesinowe) w plastikowych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Wyrzuć przylegające komórki (głównie makrofagi) na szalkach hodowlanych.
- Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
- Zawiesić osad z 1 ml pożywki RPMI 1640. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
nuta: Żywotność izolowanych leukocytów jest zwykle większa niż 90% przez wykluczenie błękitu trypanowego.
- Odwirować jak w kroku 1.7 i ponownie zawiesić komórki w ~ 200 μl zimnego buforu PBS (0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA) w stężeniu 5 - 10 x 106 komórek/ml.
- Dodać 5 μl biotynylowanego anty-ludzkiego koktajlu Ab specyficznego dla komórek krwi (dla negatywnej selekcji komórek B) na 106 komórek i inkubować na lodzie przez 30 min.
nuta: Anty-ludzki koktajl Ab powinien zawierać co najmniej Abs specyficzne dla CD2 (lub CD3), CD14 i CD16.
- Dodać 10-krotny nadmiar sterylnego PBS do komórek, odwirować przy 600 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
- Dodać równe ilości mikrogranulek sprzężonych ze streptawidyną (5 μl na10-6 komórek) do osadu i dokładnie wymieszać.
- Inkubować na lodzie przez 30 minut w plastikowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
- Dodać 2 ml buforu PBS do probówki.
- Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 8 minut. Brązowe mikrokulki będą stopniowo przyczepiać się do ścianki rurki obok magnesu.
- Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie przenieś supernatant do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
- Powtórz kroki od 1.14 do 1.16 i połącz dwa supernatanty, które zawierają nietknięte limfocyty B. Wyrzuć mikrogranulki.
- Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
- Ponownie zawiesić granulkę w podłożu RPMI 1640 w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów.
nuta: Zazwyczaj można wyizolować 1 - 5 x 105 komórek B o czystości większej niż 95% z 10 ml krwi obwodowej.
2. Oczyszczanie i oddzielanie pamięci i naiwnych komórek B od izolowanych komórek B
- Użyj komórek oczyszczonych z kroku 1 i określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
- Ponownie zawiesić komórki w 100 μl zimnego buforu PBS po odwirowaniu w stężeniu 600 x g i RT przez 5 minut.
- Dodać 1 - 2 μg biotynylowanego mAb CD27 na 106 komórek i inkubować na lodzie przez 30 minut.
- Dodać 10 ml buforu PBS do probówki i odwirowywać przy 600 x g przez 5 minut.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu PBS.
- Dodaj równe ilości mikrokulek magnetycznych streptawidyny (1 - 2 μg/106 komórek) do komórek w 15-mililitrowej plastikowej stożkowej probówce.
- Delikatnie dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
- Dodać 2 - 3 ml buforu PBS do probówki.
- Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 8 minut, aby brązowe mikrokulki przyczepiły się do strony znajdującej się najbliżej magnesu.
- Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie przenieś frakcję supernatantu do nowej sterylnej probówki. Frakcja ta zawiera wzbogacone limfocyty B nienawątkowe CD27.
- Dodać 5 ml do probówki zawierającej mikrogranulki i delikatnie zawiesić mikrogranulki (tj. wzbogaconą frakcję komórek B pamięci CD27+).
- Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ponownie zawiesić granulki z pożywką RPMI 1640 do dalszych eksperymentów.
nuta: Zazwyczaj ~ 30 - 60% limfocytów B można oczyścić jako komórki pamięci CD27+ z PBMC zdrowego dawcy.
3. Sortowanie komórek dla zbioru naiwnych komórek B, komórek B pamięci i PBs/PC
- Korzystając z komórek oczyszczonych z Kroku 1, określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
- Ponownie zawiesić komórki w zimnym buforze PBS w stężeniu10-7 na ml w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml.
- Dodać 1 - 2 μg ludzkiej IgG na10-6 komórek i inkubować na lodzie przez 10 minut w celu uzyskania bloku Fc.
- Dodać po 1 μg anty-CD19-APC (klon: HIB19), anty-CD27-eFluor450 (klon: O323) i anty-CD38-PE (klon: HIT2) na 106 komórek; dobrze wymieszać i inkubować na lodzie przez 30 min.
- W ciągu ostatnich 5 minut w kroku 3.4 dodaj 5 μl dostępnej na rynku 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD).
- Dodać 2 ml PBS do probówki, wirować i wirować przy 600 x g przez 5 minut.
- Ponownie zawiesić komórki w buforze sortującym (sterylny PBS z 2% BSA i 2 mM EDTA) w stężeniu 1 - 5 x 10 7 komórek na ml w probówce o pojemności 15 ml.
- Przefiltruj komórki przez sitko z nylonowej siatki (rozmiar porów 40 μm), aby wyeliminować grudki komórek.
- Oddziel komórki za pomocą sortera cytometrycznego przepływowego wyposażonego w trzy lasery: fioletowy (405 nm), niebieski (488 nm) i czerwony (640 nm).
nuta: Sam niebieski laser jest wystarczający do 3-kolorowej cytometrii przepływowej.
- Posortuj komórki do trzech probówek o pojemności 15 ml (zawierających 5 ml pożywki RPMI) w celu jednoczesnego zbierania naiwnych komórek B (CD19 + CD27-), komórek B pamięci (CD19 + CD27 +) i PB / PC (CD19 + CD27 + / hiCD38 +).
nuta: Posortowane naiwne i pamięciowe komórki B można hodować zgodnie z opisem w kroku 4.
>4. Różnicowanie in vitro izolowanych ludzkich komórek B CD19+, komórek B pamięci CD19+CD27+ i komórek B niewcześniej nieleczonych CD19+CD27
- Korzystając z komórek oczyszczonych w krokach 1.19, 2.10, 2.11 i 3.10, określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
- Ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki RPMI 1640 o stężeniu 1 - 10 x10,5 na ml i podać je do dołków 12-dołkowej płytki.
- Dodaj CpG (ODN 2006) w stężeniu 5 μg/106 komórek/ml.
- Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5 dni.
- Zbierz komórki z każdej studzienki, umieść je osobno w probówkach o pojemności 15 ml, dodaj 5 ml PBS do każdej probówki i odwiruj je przy 600 x g i RT przez 5 minut.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Zawiesić komórki w stężeniu 1 - 10 x 105 na ml za pomocą pożywki RPMI 1640.
5. Test ELISpot
- Dodaj 30 μl 35% etanolu w wodzie destylowanej do każdej studzienki płytek ELISpot przez 30 s.
nuta: Podczas pipetowania należy unikać dotykania membrany w studzienkach.
- Odwróć płytki ELISpot, aby usunąć etanol.
- Umieścić 150 μl autoklawizowanego ddH2O do każdej studzienki i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu wypłukania pozostałości etanolu; następnie przemywać sterylnym PBS w temperaturze pokojowej przez 3 minuty
nuta: Kroki od 5.1 do 5.3 mogą być opcjonalne, w zależności od produkcji płyt.
- Umieścić 50 μl 5 μg/ml poliklonalnego fragmentu F(ab')2 anty-ludzkiego Ig (IgG + IgM + IgA) (w PBS) do każdej studzienki na płytkach ELISpot i inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc (preferowane) lub 37 °C przez 2 godziny.
nuta: Uszczelnij krawędzie płyt Parafilmem do czasu użycia.
- Odwrócić płytki, aby usunąć niezwiązane Abs, dodać 200 μl PBS do każdego dołka i inkubować je dwukrotnie w temperaturze pokojowej przez 3 minuty za każdym razem.
- Dodać 200 μl PBS z 5% BSA (lub pożywką RPMI 1640) do każdego dołka w celu zablokowania i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
- Odwróć płytki, aby usunąć bufor blokujący. Umyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl PBS, jak w kroku 5.5.
- Dodać 100 μl pożywki RPMI 1640 do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C.
- Gdy będziesz gotowy do wysiewu komórek, odwróć płytki, aby usunąć pożywkę RPMI 1640.
- Wysiewaj 100 μl (5 x 104), 50 μl (2,5 x 104) i 25 μl (1,25 x 104) komórek (z kroków 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 i 4.6) do dołków płytki ELISpot. Za pomocą pożywki RPMI 1640 doprowadzić objętość do 150 μl/studzienkę.
nuta: Zaleca się co najmniej jedno lub dwa 2-krotne seryjne rozcieńczenia do powlekania komórek.
- Inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 8 - 14 godzin. Unikać przesuwania płytek podczas inkubacji.
- Odwróć płytki, aby usunąć komórki i pożywkę RPMI 1640.
- Dodać 200 μl/basenik PBS-T (PBS z 0,05% Tween 20) i inkubować je 5 razy w temperaturze sotki, za każdym razem przez 3 minuty. Odwrócić płytkę, aby usunąć bufor do płukania między każdym z 5 płukań.
- Dodać kozią anty-ludzką fosfatazę alkaliczną IgG (AP), Abs specyficzny dla Fcγ (do wykrywania IgG, 1:5 000 w PBS-T) lub kozie anty-ludzkie IgM-AP, Fcμ specyficzne dla fragmentów Abs (do wykrywania IgM, 1:5 000 w PBS-T) do wyznaczonych dołków i inkubować w RT przez 2 godziny w ciemności.
- Umyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl PBS, jak w kroku 5.5.
- Dodać 50 μl/studzienkę roztworu substratu bromochloroindolilofosforanu i błękitu tetrazolowego (BCIP/NBT). Fioletowe plamy pojawiają się zwykle po 5 - 15 minutach.
- Dodać 100 μl/basenik ddH2O, aby zapobiec nadmiernemu rozwojowi plam.
- Opłucz płytki bieżącą wodą z kranu po całkowitym rozwinięciu się wszystkich plam.
- Usuń odpływ płytek i pozwól im wyschnąć na powietrzu w ciemności.
- Policz plamki za pomocą automatycznego czytnika płytek z jednostką akwizycji/analizy obrazu (np. skanerem automatycznym lub ręcznie za pomocą mikroskopu preparacyjnego).
nuta: Płyty mogą być przechowywane w RT w ciemności i analizowane później.
