Ocena funkcjonalna limfocytów B wydzielających przeciwciała za pomocą testu ELISpot

Streszczenie

Źródło: Tzeng, S. J. Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich komórek B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje użycie testu ELISpot do oceny funkcji komórek B wydzielających przeciwciała, ASC. Przeciwciała wydzielane przez ASC oddziałują z fragmentami przeciwciał poliklonalnych związanymi z błoną, które są wykrywane przez przeciwciała IgG lub IgM sprzężone z enzymem. Kolorowa plamka wytworzona w każdym dołku wskazuje na obecność specyficznego izotypu przeciwciała, który koreluje z aktywnością wydzielniczą limfocytów B.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

Ludzka krew obwodowa musi być pobierana od zdrowych dawców za świadomą zgodą, a użycie próbek krwi musi być zgodne z zatwierdzonymi wytycznymi ustalonymi przez komisje rewizyjne. W tym badaniu przedstawiono protokół wykorzystania ludzkiej krwi w demonstracji wyników cytometrii przepływowej (ryc. 1) i testów ELISpot (ryc. 2).

1. Izolacja i oczyszczanie ludzkich komórek B krwi obwodowej

1. Pobrać ~ 10 ml krwi z żyły łokciowej środkowej (w dole łokciowym przed łokciem) do 15-mililitrowej probówki zawierającej_K2EDTA(1,5 do 2,0 mg/ml krwi) i natychmiast kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów.
2. Dodać 35 ml autoklawowanego (121 °C, 15 min) buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) (150 mM NH₄Cl, 10 mM_KHCO3 i 1 mM EDTA; pH 7,4) do probówki zawierającej świeżą próbkę krwi (≥ 3:1 obj./obj.) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) nie dłużej niż 5 min.
   nuta: Pojawienie się przepuszczalności światła przez rurkę wskazuje na zakończenie lizy RBC.
3. Wirować przy 600 x g przy RT przez 5 minut. Upewnij się, że osad ma biały kolor.
4. Zawiesić osad w 10 ml autoklawowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄ i 1,47 mM KH₂PO₄; pH 7,4) i odwirować jak w kroku 1.3.
5. Wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad z 10 ml pożywki RPMI 1640 (dodatki: 10% płodowej surowicy cielęcej, 100 μg/ml penicyliny/streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 2 mM L-glutaminy), a następnie umieść komórki w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym (10 ml krwi na szalkę). Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ na 30 minut.
6. Delikatnie zakręć naczyniem hodowlanym kilka razy i umieść pożywkę hodowlaną (komórki zawiesinowe) w plastikowych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Wyrzuć przylegające komórki (głównie makrofagi) na szalkach hodowlanych.
7. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
8. Zawiesić osad z 1 ml pożywki RPMI 1640. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
   nuta: Żywotność izolowanych leukocytów jest zwykle większa niż 90% przez wykluczenie błękitu trypanowego.
9. Odwirować jak w kroku 1.7 i ponownie zawiesić komórki w ~ 200 μl zimnego buforu PBS (0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA) w stężeniu 5 - 10 x 10⁶ komórek/ml.
10. Dodać 5 μl biotynylowanego anty-ludzkiego koktajlu Ab specyficznego dla komórek krwi (dla negatywnej selekcji komórek B) na 10⁶ komórek i inkubować na lodzie przez 30 min.
    nuta: Anty-ludzki koktajl Ab powinien zawierać co najmniej Abs specyficzne dla CD2 (lub CD3), CD14 i CD16.
11. Dodać 10-krotny nadmiar sterylnego PBS do komórek, odwirować przy 600 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
12. Dodać równe ilości mikrogranulek sprzężonych ze streptawidyną (5 μl na^10-6 komórek) do osadu i dokładnie wymieszać.
13. Inkubować na lodzie przez 30 minut w plastikowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
14. Dodać 2 ml buforu PBS do probówki.
15. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 8 minut. Brązowe mikrokulki będą stopniowo przyczepiać się do ścianki rurki obok magnesu.
16. Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie przenieś supernatant do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
17. Powtórz kroki od 1.14 do 1.16 i połącz dwa supernatanty, które zawierają nietknięte limfocyty B. Wyrzuć mikrogranulki.
18. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
19. Ponownie zawiesić granulkę w podłożu RPMI 1640 w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów.
    nuta: Zazwyczaj można wyizolować 1 - 5 x 10⁵ komórek B o czystości większej niż 95% z 10 ml krwi obwodowej.

2. Oczyszczanie i oddzielanie pamięci i naiwnych komórek B od izolowanych komórek B

1. Użyj komórek oczyszczonych z kroku 1 i określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
2. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl zimnego buforu PBS po odwirowaniu w stężeniu 600 x g i RT przez 5 minut.
3. Dodać 1 - 2 μg biotynylowanego mAb CD27 na 10⁶ komórek i inkubować na lodzie przez 30 minut.
4. Dodać 10 ml buforu PBS do probówki i odwirowywać przy 600 x g przez 5 minut.
5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu PBS.
6. Dodaj równe ilości mikrokulek magnetycznych streptawidyny (1 - 2 μg/10⁶ komórek) do komórek w 15-mililitrowej plastikowej stożkowej probówce.
7. Delikatnie dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
8. Dodać 2 - 3 ml buforu PBS do probówki.
9. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 8 minut, aby brązowe mikrokulki przyczepiły się do strony znajdującej się najbliżej magnesu.
10. Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie przenieś frakcję supernatantu do nowej sterylnej probówki. Frakcja ta zawiera wzbogacone limfocyty B nienawątkowe CD27^.
11. Dodać 5 ml do probówki zawierającej mikrogranulki i delikatnie zawiesić mikrogranulki (tj. wzbogaconą frakcję komórek B pamięci CD27⁺).
12. Wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ponownie zawiesić granulki z pożywką RPMI 1640 do dalszych eksperymentów.
    nuta: Zazwyczaj ~ 30 - 60% limfocytów B można oczyścić jako komórki pamięci CD27⁺ z PBMC zdrowego dawcy.

3. Sortowanie komórek dla zbioru naiwnych komórek B, komórek B pamięci i PBs/PC

1. Korzystając z komórek oczyszczonych z Kroku 1, określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
2. Ponownie zawiesić komórki w zimnym buforze PBS w stężeniu^10-7 na ml w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml.
3. Dodać 1 - 2 μg ludzkiej IgG na^10-6 komórek i inkubować na lodzie przez 10 minut w celu uzyskania bloku Fc.
4. Dodać po 1 μg anty-CD19-APC (klon: HIB19), anty-CD27-eFluor450 (klon: O323) i anty-CD38-PE (klon: HIT2) na 10⁶ komórek; dobrze wymieszać i inkubować na lodzie przez 30 min.
5. W ciągu ostatnich 5 minut w kroku 3.4 dodaj 5 μl dostępnej na rynku 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD).
6. Dodać 2 ml PBS do probówki, wirować i wirować przy 600 x g przez 5 minut.
7. Ponownie zawiesić komórki w buforze sortującym (sterylny PBS z 2% BSA i 2 mM EDTA) w stężeniu 1 - 5 x 10 7 komórek na ml w probówce o pojemności 15 ml.
8. Przefiltruj komórki przez sitko z nylonowej siatki (rozmiar porów 40 μm), aby wyeliminować grudki komórek.
9. Oddziel komórki za pomocą sortera cytometrycznego przepływowego wyposażonego w trzy lasery: fioletowy (405 nm), niebieski (488 nm) i czerwony (640 nm).
   nuta: Sam niebieski laser jest wystarczający do 3-kolorowej cytometrii przepływowej.
10. Posortuj komórki do trzech probówek o pojemności 15 ml (zawierających 5 ml pożywki RPMI) w celu jednoczesnego zbierania naiwnych komórek B (CD19 ⁺ CD27^-), komórek B pamięci (CD19 ⁺ CD27 ⁺) i PB / PC (CD19 ⁺ CD27 ^{+ / hi}CD38 ⁺).
    nuta: Posortowane naiwne i pamięciowe komórki B można hodować zgodnie z opisem w kroku 4.

>4. Różnicowanie in vitro izolowanych ludzkich komórek B CD19⁺, komórek B pamięci CD19⁺CD27⁺ i komórek B niewcześniej nieleczonych CD19⁺CD27

1. Korzystając z komórek oczyszczonych w krokach 1.19, 2.10, 2.11 i 3.10, określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
2. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki RPMI 1640 o stężeniu 1 - 10 x^10,5 na ml i podać je do dołków 12-dołkowej płytki.
3. Dodaj CpG (ODN 2006) w stężeniu 5 μg/10⁶ komórek/ml.
4. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 5 dni.
5. Zbierz komórki z każdej studzienki, umieść je osobno w probówkach o pojemności 15 ml, dodaj 5 ml PBS do każdej probówki i odwiruj je przy 600 x g i RT przez 5 minut.
6. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Zawiesić komórki w stężeniu 1 - 10 x 10⁵ na ml za pomocą pożywki RPMI 1640.

5. Test ELISpot

1. Dodaj 30 μl 35% etanolu w wodzie destylowanej do każdej studzienki płytek ELISpot przez 30 s.
   nuta: Podczas pipetowania należy unikać dotykania membrany w studzienkach.
2. Odwróć płytki ELISpot, aby usunąć etanol.
3. Umieścić 150 μl autoklawizowanego ddH₂O do każdej studzienki i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu wypłukania pozostałości etanolu; następnie przemywać sterylnym PBS w temperaturze pokojowej przez 3 minuty
   nuta: Kroki od 5.1 do 5.3 mogą być opcjonalne, w zależności od produkcji płyt.
4. Umieścić 50 μl 5 μg/ml poliklonalnego fragmentu F(ab')₂ anty-ludzkiego Ig (IgG + IgM + IgA) (w PBS) do każdej studzienki na płytkach ELISpot i inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc (preferowane) lub 37 °C przez 2 godziny.
   nuta: Uszczelnij krawędzie płyt Parafilmem do czasu użycia.
5. Odwrócić płytki, aby usunąć niezwiązane Abs, dodać 200 μl PBS do każdego dołka i inkubować je dwukrotnie w temperaturze pokojowej przez 3 minuty za każdym razem.
6. Dodać 200 μl PBS z 5% BSA (lub pożywką RPMI 1640) do każdego dołka w celu zablokowania i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
7. Odwróć płytki, aby usunąć bufor blokujący. Umyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl PBS, jak w kroku 5.5.
8. Dodać 100 μl pożywki RPMI 1640 do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C.
9. Gdy będziesz gotowy do wysiewu komórek, odwróć płytki, aby usunąć pożywkę RPMI 1640.
10. Wysiewaj 100 μl (5 x 10⁴), 50 μl (2,5 x 10⁴) i 25 μl (1,25 x 10⁴) komórek (z kroków 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 i 4.6) do dołków płytki ELISpot. Za pomocą pożywki RPMI 1640 doprowadzić objętość do 150 μl/studzienkę.
    nuta: Zaleca się co najmniej jedno lub dwa 2-krotne seryjne rozcieńczenia do powlekania komórek.
11. Inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 8 - 14 godzin. Unikać przesuwania płytek podczas inkubacji.
12. Odwróć płytki, aby usunąć komórki i pożywkę RPMI 1640.
13. Dodać 200 μl/basenik PBS-T (PBS z 0,05% Tween 20) i inkubować je 5 razy w temperaturze sotki, za każdym razem przez 3 minuty. Odwrócić płytkę, aby usunąć bufor do płukania między każdym z 5 płukań.
14. Dodać kozią anty-ludzką fosfatazę alkaliczną IgG (AP), Abs specyficzny dla Fcγ (do wykrywania IgG, 1:5 000 w PBS-T) lub kozie anty-ludzkie IgM-AP, Fcμ specyficzne dla fragmentów Abs (do wykrywania IgM, 1:5 000 w PBS-T) do wyznaczonych dołków i inkubować w RT przez 2 godziny w ciemności.
15. Umyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl PBS, jak w kroku 5.5.
16. Dodać 50 μl/studzienkę roztworu substratu bromochloroindolilofosforanu i błękitu tetrazolowego (BCIP/NBT). Fioletowe plamy pojawiają się zwykle po 5 - 15 minutach.
17. Dodać 100 μl/basenik ddH₂O, aby zapobiec nadmiernemu rozwojowi plam.
18. Opłucz płytki bieżącą wodą z kranu po całkowitym rozwinięciu się wszystkich plam.
19. Usuń odpływ płytek i pozwól im wyschnąć na powietrzu w ciemności.
20. Policz plamki za pomocą automatycznego czytnika płytek z jednostką akwizycji/analizy obrazu (np. skanerem automatycznym lub ręcznie za pomocą mikroskopu preparacyjnego).
    nuta: Płyty mogą być przechowywane w RT w ciemności i analizowane później.

Wyniki

Rysunek 1. Ilustracja strategii bramkowania w celu oddzielenia naiwnych komórek B, komórek B pamięci i PB w PBMC. (A) Komórki (2 x 10⁶) barwiono po 2 μg mAb CD19-APC, CD27-eFluor450 i CD38-PE (krok 3.4). Przedział limfocytów był bramkowany (G1) na wykresie kropkowym dla rozpraszania do przodu (FSC) w porównaniu z rozpraszaniem bocznym (SSC). (B) Dublety komórkowe, które s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odkurzacz BD K2E	BD Nauki biologiczne	367525	Tubka 10 ml
Ficoll-Paque Plus	GE Opieka zdrowotna	17-1440-02	Nie zawiera endotoksyn
Błękit trypanowy 0,5% roztwór	Przemysł biologiczny	03-102-1B
IMag Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów B	BD Nauki biologiczne	558007
Biotynylowany mAb CD27	Legenda biologiczna	302804	Klon O323
Mikrokulki magnetyczne streptawidyny	BD Nauki biologiczne	9000810
Probówki Falcon 15 ml	BD Sokół	352196
Niebieski sitko z siatki nylonowej, 40 μm	BD Sokół	Numer telefonu 352340
Anty-ludzki CD19-APC	Legenda biologiczna	302212	Klon HIB19
Anty-ludzki CD27-eFluor 450	eBionauka	Numer telefonu 48-0279-42	Klon O323
Anty-ludzki CD38-PE-Cy7	Legenda biologiczna	303516	Klon HIT2
Anty-ludzki CD38-PE-Cy7	BD Nauki biologiczne	560677	Klon HIT2
Anty-ludzki CD45-FITC	Legenda biologiczna	304006	Klon HI30
Anty-ludzki CD45-FITC	BD Nauki biologiczne	555482	Klon HI30
Anty-mysz/szczur/człowiek CD27-PerCP Cy5.5	Legenda biologiczna	124213	Klon LG.3A10
Anty-ludzki CD27-PerCP Cy5.5	BD Nauki biologiczne	Numer katalogowy: 65429	Klon L128
Anty-ludzki CD19-FITC	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-098-064	Klon LT19
Anty-ludzki CD19-FITC	GeneTex (Certyfikat genetyczny	GTX75599	Klon LT19
Anty-ludzki CD20-FITC	BD Nauki biologiczne	555622	Klon 2H7
Biotynylowany anty-ludzki CD27	Legenda biologiczna	302804	Klon O323
Biotynylowany anty-ludzki CD27	eBionauka	Numer katalogowy: 13-0279-80	Klon O323
7-aminoaktynomycyna D (7-AAD)	BD Nauki biologiczne	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	TLRL-2006	Typ B CpG
Rekombinowana ludzka IL-2	PeproTech	200-02
Rekombinowana ludzka IL-10	PeproTech	200-10
Rekombinowana ludzka IL-21	PeproTech	200-21 Rozdział 200-21
Rekombinowany ludzki sCD40L	PeproTech	310-02
Białko A S. aureus Cowan (SAC)	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 82526
Mitogen z pokeweed (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
Płytki filtracyjne MultiScreen, wielkość porów 0,45 μm	Merck Millipore	MSIPS4510	Sterylna, przezroczysta 96-dołkowa płyta filtracyjna z hydrofobową membraną PVDF
Rozwiązanie BCIP/NBT	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał B6404
Pojedynczy odczynnik BCIP/NBT, substrat fosfatazy alkalicznej	Merck Millipore	Zobacz materiał ES006
Ludzka IgG	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer telefonu 009-000-003
Ludzka IgG, fragment Fc	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 009-000-008
F(ab')2 fragment koziego anty-ludzkiego Ig (IgG+IgM+IgA)	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 109-006-127
Kozia anty-ludzka fosfataza alkaliczna IgG, specyficzna dla fragmentu Fcγ	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 109-055-008
Kozia anty-ludzka fosfataza alkaliczna IgM, specyficzna dla fragmentu Fcμ	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 109-055-095
Kozia anty-ludzka peroksydaza IgG, specyficzna dla fragmentu Fcγ	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 109-035-008
Kozia anty-ludzka peroksydaza IgM, specyficzna dla fragmentu Fcμ	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 109-035-095
Zestaw podłoży BD ELISPOT AEC	BD Nauki biologiczne	551951
Analizator C.T.L. ImmunoSpot	C.T.L.