Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zbiór kości z myszy
- Poddaj zwierzęta eutanazji za pomocą CO2 , a następnie zwichnięciu szyjki macicy i spryskaj je 70% etanolem.
nuta: Należy zapewnić, aby wykorzystywano zwierzęta tej samej płci i najlepiej w tym samym wieku. Rutynowo wykorzystujemy zwierzęta w wieku od 7 do 8 tygodni. Zalecamy łączenie komórek z co najmniej 3 zwierząt w grupie doświadczalnej, aby uzyskać lepiej reprezentatywną i odtwarzalną populację komórek.
- Umieść uśpioną mysz na plecach na desce sekcyjnej. Użyj kleszczy, aby stworzyć namiot ze skóry na brzuchu. Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych. Oderwij skórę w kierunku kończyn i stóp od rozcięcia, aby odsłonić dolną część brzucha i nogi.
- Wytnij poniżej stawu skokowego, aby usunąć stopę. Przeciąć wzdłuż grzebienia biodrowego w biodrze, aby oddzielić głowę kości udowej od kości biodrowej. Gdy mysz jest jeszcze na grzbiecie, wykonaj nacięcie na środku kości biodrowej, aby oddzielić dwie kości biodrowe.
- Za pomocą niestrzępiących się chusteczek ostrożnie usuń mięsień z kości udowych, piszczelowych i biodrowych.
nuta: Wycięcie jak największej ilości ścięgien i mięśni z kości sprawia, że czyszczenie jest szybsze i łatwiejsze dzięki niestrzępiącym się chusteczkom (np. chusteczkom Kim). Zachowaj ostrożność podczas manipulowania kośćmi, ponieważ mają one tendencję do łatwego łamania się, a ich kruchość może być zwiększona w przypadku niektórych genotypów.
- Po wycięciu wszystkich próbek umieścić je w PBS na lodzie i przenieść do sterylnego kaptura hodowlanego na pozostałe etapy izolacji.
nuta: Praca w aseptyce w jak największym stopniu zmniejszy ryzyko zanieczyszczenia kultur.
- Wykonaj małe nacięcia (około 1 do 2 mm) zarówno na bliższym, jak i dalszym końcu kości przed umieszczeniem ich w podzielonych na sekcje końcówkach w probówkach wirówkowych.
nuta: Upewnij się, że wycięto wystarczającą ilość, aby szpik mógł zostać odwirowany; Należy jednak zachować ostrożność, aby nie ciąć zbyt mocno, ponieważ populacje komórek mają tendencję do różnicowania się w zależności od odległości w przestrzeni szpikowej.
- Wirować przy 10 000 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że cały szpik został przepłukany i granulowany na dnie probówki o pojemności 1,5 ml, podczas gdy kości znajdują się wewnątrz wkładek (końcówka pipety o pojemności 200 μl lub probówka do mikrowirówki o pojemności 0,75 ml). Po pobraniu całego szpiku należy usunąć wkładki z kośćmi z probówek.
nuta: Jeśli cały szpik zostanie zaczerwieniony, kości będą wyglądały na białe. Jeśli jednak szpik pozostanie w niektórych kościach, spróbuj ponownie obciąć końcówki i odwirować.
2. Zawieszenie komórek
- Za pomocą igły 25 G powoli pociągnij granulki komórek w górę i w dół, aby rozbić grudki i połącz wszystkie próbki w jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej BMSC na 500 μl próbek.
- Umieść filtr 70 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przepuść zawiesinę komórek przez ten filtr w celu usunięcia ewentualnych fragmentów kości.
3. Posiew i hodowla mieszanych populacji komórek szpiku kostnego (całkowite BMC)
UWAGA: Komórki są hodowane w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.
- Obliczyć liczbę komórek i pokryć je w pożywce hodowlanej w proporcji 1,0 x 106 komórek/cm2. Odczekać, aż 72 godziny mieszanej kultury się przyłączą.
nuta: Zalecamy rozcieńczenie zawiesiny komórkowej 20x w pożywce hodowlanej i ponowne rozcieńczenie w błękicie trypanowym przed zliczeniem komórek za pomocą hemocytometru. W przypadku 7-tygodniowych samców myszy C57Bl6 / J rutynowo uzyskujemy liczbę komórek około 50 x 106 komórek, ale wiek, płeć i szczep mogą znacznie wpływać na liczbę komórek.
nuta: Mieszana populacja komórek powinna dobrze przyczepić się na dnie kultury.
- Po 72 godzinach wyjmij nośnik i zastąp go nowym nośnikiem. Kontynuuj zmianę nośnika co drugi dzień i sprawdzaj, czy nie ma zbiegów. Kiedy komórki osiągną 80-100% zbieżności, są gotowe do różnicowania.
nuta: Ponieważ kultura ta jest mieszana zarówno z BMSC, jak i HSC, może być bezpośrednio stosowana do osteoblastogenezy, adipogenezy, a także osteoklastogenezy.
4. Poszycie i kultura podzielonej populacji BMSC (adherent BMSC)
UWAGA: Komórki są hodowane w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.
- Umieść wszystkie komórki pobrane z kości udowych, piszczelowych i biodrowych jednej myszy w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm (55cm2 obszaru hodowlanego).
nuta: Łącząc 2-3 myszy C57BL/6J, zazwyczaj umieszczamy tę "całkowitą" populację szpiku kostnego w kolbieo długości 150 cm2.
- Po 48 godzinach mieszanej hodowli usunąć pożywki hodowlane (zawierające nieprzylegające HSC). Jeśli ma być przeprowadzone doświadczenie osteoklastogenezy, należy odłożyć tę populację komórek nieprzylegających na bok (patrz punkt 7), jeśli nie, odessać i wyrzucić te komórki.
- Ostrożnie umyć płytkę/kolbę PBS, aby nie naruszyć przyczepionych komórek.
- Usuń PBS i podnieś komórki, dodając 0,25% trypsyny i inkubując w temperaturze 37 °C przez 1-3 minuty. Ugasić trypsynę, dodając pożywkę komórkową do zawiesiny komórkowej. W tym momencie BMSC, które są teraz podniesione, mogą zostać policzone (jak to wcześniej zrobiono w kroku 4.1) i posiane do przyszłych eksperymentów.
- Oblicz liczbę komórek potrzebnych do poszycia. Odwirować wymaganą objętość zawiesiny komórkowej przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
nuta: Komórki są zwykle siane na podstawie eksperymentów w punktach końcowych. Na przykład, jeśli białko / RNA ma zostać wyizolowane, zwykle płytkujemy o większej gęstości (~ 1,0-2,0 x 106 komórek / dołek na płytce 6-dołkowej).
- Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w objętości pożywki hodowlanej potrzebnej do posiewu. Umieść komórki w pożywkach hodowlanych zgodnie z doświadczeniami i pozwól im się przyczepić na kilka dni. Gdy BMSC osiągną zbieg, przystąp do przeprowadzenia różnicowania.
