Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Hodowla aktywowanych ludzkich pierwotnych limfocytów T
- Rozmrażanie komórek (dzień 1)
- Podgrzej 10 ml RPMI 1640 na próbkę do około 37 °C.
- Weź żądaną liczbę ampułek z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej i przechowuj je tymczasowo na suchym lodzie.
- Ponownie zawiesić zamrożone komórki w 10 ml wstępnie podgrzanego RPMI 1640.
- Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej.
- Odrzucić supernatant i ponownie przemyć komórki poprzez ponowne zaparcie w 10 ml RPMI 1640 i odwirować zgodnie z opisem w ppkt 1.1.4.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 2 x 106 komórek na ml pożywki X-VIVO 15 + 5% surowicy ludzkiej (dalej: pożywka z komórek T).
- Umieścić 2 ml komórek na basenie na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Aktywacja komórek (dzień 0)
- Umyj kulki CD3/CD28, przenosząc 12,5 μl kulek na 1 milion komórek do probówki mikrowirówkowej. Dodać 12,5 μl PBS na 12,5 μl kulek.
nuta: Ważne jest, aby przed użyciem przemieszać fiolkę z kulkami.
- Umieść probówkę mikrowirówki na odpowiednim magnesie na 1 minutę.
- Odrzucić bufor i ponownie zawiesić kulki w pierwotnej objętości pożywki z limfocytów T (12,5 μl pożywki z komórek T na 12,5 μl pierwotnej objętości kulek).
- Dodać 12,5 μl kulek na milion komórek, co odpowiada stosunkowi 1:2 (kulki: komórki).
- Podziel komórki na dwa warunki, z których każdy ma około 5 milionów komórek.
- Dodać odpowiednią objętość cytokin do warunków wymienionych w Tabeli 1.
- Inkubować komórki przez 3 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Hodowla komórek (dzień 3 i 5)
- Ponownie zawieś komórki i podziel je, przenosząc połowę objętości z każdej studzienki do nowej studzienki. Dodaj taką samą objętość świeżej pożywki z komórek T do każdej studzienki.
- Dodaj nowe cytokiny do każdego stanu, jak wspomniano w Tabeli 1.
osób
szt.
| Cytokina | skład | Współczynnik rozcieńczenia | finał |
| Warunek 1 | IŁ-2 | 3 x 106 U/ml | 30 000 | 100 j./ml |
| Warunek 2 | IŁ-15 | 2 x 105 U/ml | 2 000 | 100 j./ml |
Tabela 1: Przygotowanie kultur cytokin używanych do kierowania zmianami metabolicznymi w limfocytach T.
