Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja pojedynczej komórki z PDLN
- Umieść sterylną metalową siatkę o grubości 250 μm na stożkowej probówce o pojemności 15 ml w stojaku. Opłucz siatkę 1 ml RPMI.
- Przenieś węzły chłonne na metalową siatkę i przetrzyj je przez siatkę za pomocą pęsety. Nałóż 1 ml RPMI na metalową siatkę, aby spłukać komórki do probówki. Powtórz jeszcze 3 razy i usuń siatkę.
- Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w około 5 ml RPMI. Napełnij rurki RPMI.
- Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w około 5 ml RPMI. Napełnij rurki RPMI.
- Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml RPMI. Przenieść 2 ml zawiesiny komórek do probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml z nakrętkami do sitka komórkowego. Nanieść zawiesinę komórkową na nasadki sitka do komórek.
2. Cytometria przepływowa
- Odwirować zawiesiny komórkowe z PDLN przy 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
- Wybarwić komórki następującymi przeciwciałami powierzchniowymi w 100 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej (bufor FACS): 0,75 μg/100 μl przeciwciała CD4 sprzężonego z FITC, 0,60 μg/100 μl przeciwciała CD8 sprzężonego z APC-H7, 0,30 μg/100 μl przeciwciała CD25 sprzężonego z PE, 5 μl (1:20) przeciwciała Nrp1 sprzężonego z APC. Inkubować probówki na lodzie przez 40 minut.
- Dodać 200 μl buforu FACS do każdej probówki. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad. Powtórz jeszcze raz.
- Utrwalić i przepuszczalnie komórki poprzez ponowne zawieszenie osadu komórkowego w 500 μl buforu utrwalającego permeabilizację (PFB).
nuta: PFB przygotowuje się przez zmieszanie 1 części koncentratu utrwalającego/przepuszczalnego z 3 częściami rozcieńczalnika utrwalającego/przepuszczalnego.
- Przechowywać probówki w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc.
nuta: Działa również 1 godzinna inkubacja.
- Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
- Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu do przemywania permeabilizacji (PWB). Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
nuta: PWB otrzymuje się przez rozcieńczenie buforu permeabilizacyjnego (10x) do 1:10 w wodzie destylowanej.
- Wybarwić komórki następującymi przeciwciałami wewnątrzkomórkowymi w 100 μl PWB: 0,30 μg/100 μl przeciwciała Foxp3 sprzężonego z PE-Cy7, 4 μl (1: 25) przeciwciała Helios sprzężonego z PacificBlue. Inkubować probówki na lodzie przez 1 godzinę.
- Dodać 500 μl PWB do każdej probówki. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
- Zawiesić osad komórkowy w 500 μl PWB. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
- Zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforu FACS.
- Przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym.
- Bramkowanie pojedynczych komórek na podstawie bocznego obszaru rozproszenia, wysokości i szerokości oraz obszaru rozproszenia do przodu, wysokości i szerokości. Uruchom milion zdarzeń do analizy.
- Eksportuj pliki FCS eksperymentów i analizuj je za pomocą oprogramowania do analizatora cytometrii przepływowej.
